1　材料和方法

　　1.1　主要试剂及仪器

　　DMEM培养基、小牛血清(杭州四季青生物制品厂)、分散酶Dispase Ⅱ、胰蛋白酶、兔抗人细胞角蛋白抗体(Zymed公司)、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Zymed公司)、内皮素放射免疫检测试剂盒(购自北京东亚免疫技术研究所)TGFβ₁ ELISA试剂盒(购自深圳晶美生物工程有限公司,为美国Genzyme公司产品)、24孔培养板(Nunclon公司)、γ计数器(中国科学技术大学开发研究院)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　KC的培养与鉴定 标本来源及KC的培养、鉴定方法见参考文献［7］。

　　1.2.2　ET的测定 将KC细胞以2×10⁵/ml的密度接种于24孔板,待细胞达70%～80%融合时,换用新鲜培养基。培养48 h,收集培养细胞上清液,-70℃保存,用于检测ET和TGFβ₁。采用ET放射免疫药盒,使用GC-911放射免疫伽马计数器,严格按药盒要求的操作方法检测标本中的ET值。每1组均设3个平行孔。

　　1.2.3　TGFβ₁的测定 由于细胞分泌的TGFβ₁一般为非活化型,需进行激活后再检测,取200 μl稀释液加入到200 μl细胞上清液标本中,再加入1 mol/L HCl₂ 20 μl 2～8℃放置1 h,使TGFβ₁激活,然后加入1 mol/L NaOH 15 μl进行中和。采用市售TGFβ₁ ELISA试剂盒检测样品中TGFβ₁含量。在450 nm处读数,记录OD值,绘制标准曲线,以样本的OD值推算TGFβ₁浓度。

　　1.2.4　统计学方法 应用SPSS软件进行数据分析,均数比较采用方差分析,OSF-KC分泌ET和TGFβ₁的关系采用直线相关分析,检验标准α=0.05。

　　2　结 果

　　KC分泌的ET及TGFβ₁水平：由表1可见,口腔粘膜KC能分泌一定基础水平的ET和TGFβ₁,而且OSF-KC分泌的ET及TGFβ₁水平均高于NM-KC的分泌量(P＜0.05),经直线相关分析发现OSF-KC分泌的ET和TGFβ₁之间呈正相关(r=0.968,P＜0.05)。

表1　口腔粘膜KC分泌的ET和TGFβ₁水平(±s)

* OSF-KC与NM-KC比较P＜0.05

　　3　讨 论

　　口腔粘膜上皮细胞多为KC,近年的研究表明KC不但能产生许多大分子量分子(如细胞角蛋白及粘多糖)保持口腔粘膜生化及物理的完整性;而且可分泌一系列具有免疫、炎性、增殖性特点的细胞因子

^［5，6］。KC可作为“信号传感器”,外源性刺激可使之产生细胞因子、粘附分子及趋化因子等,进而导致炎症反应。但是KC及其分泌的细胞因子是否参与了OSF的发病过程,目前国内外报道较少,本研究结果显示OSF-KC分泌的ET和TGFβ₁水平明显高于NM-KC,且两者呈正相关,说明KC及其分泌的ET和TGFβ₁可能在OSF发生中起重要作用。

　　ET是一类由21个氨基酸组成的血管活性肽,有3种异构体。ET被认为是一种内源性损伤因子^［8］,它不仅具有血管收缩功能,而且具有丝裂原作用。ET可以通过刺激FB增殖,促进其胶原合成、抑制胶原降解以及使FB向肌纤维母细胞转换等作用而引起组织纤维化^［9］,与动脉粥样硬化、肺纤维化、肝纤维化、肾小球硬化、硬皮病等纤维性疾病的发生密切相关^［8］。TGFβ₁是一类具有多种生物学活性的细胞因子,与一些纤维性疾病的发生、发展密切相关。高义军等^［6］研究发现OSF组织KC内TGFβ₁ mRNA呈阳性表达,结合本研究结果可以推断TGFβ₁确实与OSF的发生密切相关。ET与TGFβ₁是调节细胞生长和细胞外基质代谢的两种重要介质,最近的研究发现ET和TGFβ₁可相互调节其产生和活性。结合以往的资料和本研究结果,作者认为ET和TGFβ₁是复杂的细胞因子网络中的两个重要成员,OSF-KC分泌的ET和TGFβ₁水平均显著高于正常,两者呈正相关,证明两者间存在着相互影响,相互协调,最终导致FB增殖,细胞外基质堆积。

　　尽管目前还未彻底了解到ET和TGFβ₁是如何由KC分泌及它们在OSF发生中的确切作用,但是可以推测外源性刺激物如槟榔及其有效成份可使KC微环境改变,导致其分泌一系列细胞因子,从而参与诱发OSF。因此作者认为可以采用ET和TGFβ₁受体拮抗剂和相应的抗体等来拮抗和阻断ET及TGFβ₁的致病作用。