【摘要】目的：了解类金刚石碳－钛复合材料对动物免疫系统的影响。方法：利用化学气相沉积法将类金钢石碳镀于金属钛表面（厚约1μm)，制成类金钢石碳—钛复合体（Diamond－Like－CarbonTitanium,DLC－Ti)，并以纯钛、医用不锈钢、纯铜作对照，分别植入小鼠体内，手术后1、2、3、4和6周检测外周血T淋巴细胞亚群CD4、CD8阳性细胞率及CD4与CD8比值(CD4/CD8)的变化情况。比较受试材料对机体免疫系统的影响。结果：DLC－Ti对免疫系统只具有短时间的抑制作用，在第2周和第3周时对CD4和CD8分别有明显的抑制作用，实验后期则无明显影响，而其它三种材料对小鼠T淋巴细胞亚群始终存在明显的抑制作用。结论：类金刚石碳－钛材料有较好的生物相容性，是有潜力的临床复合种植材料。
纯钛做为种植材料虽然已广泛应用于临床，但纯钛具有慢性腐蚀，高弹性模量，应力传递不均，骨适应性差的缺点[1,2],而现在国内外较多采用涂羟基磷灰石的钛种植体。虽然骨整合起动早，但临床及有关资料都证实羟基磷灰石涂层时有剥脱现象。本实验选用的DLC－Ti复合体是利用等离子化学气相沉积法将DLC镀于钛表面形成的复合体。该DLC涂层经X线结构分析证明是非晶碳膜，电子探针分析为表面纯碳，并无钛及其它杂质出现。电阻率约为10－8Ω/cm2,显微硬度约2000kg/mm2,膜与钛基体的粘结强度用直接拉伸法测定不低于23MPa,在3％NaCl溶液中浸泡6年至今膜未出现剥落，电化学腐蚀试验结果表明，涂覆DLC的钛试样具有很好的耐腐蚀性[3]。体外细胞培养实验证实DLC－Ti具有良好的生物相容性[4],骨内种植的酶组化研究表明植入DLC－Ti后成骨活动启动早，植入后2个月基本达到骨整合[5]。本实验将其与纯钛、医用不锈钢相比较，以种植术后机体T淋巴细胞亚群为指标，比较受试材料对小鼠外周血免疫状况的影响。为临床优选更好的种植材料提供免疫学依据。
1 材料和方法
1.1 植入材料
选用4种材料：DLC－Ti、纯钛、8－18镍铬不锈钢合金、纯铜（作阳性对照）。上述材料制备成5mm×2mm×1mm长方体，于实验前酒精梯度脱酯，高压灭菌后放入无菌生理盐水中备用。
1.2 动物实验方法
选用健康雄性BALB/C鼠，共175只，体重182克，随机分作5组，每组35只，分别为A—对照组；B—DLC－Ti组；C—纯钛组；D—医用不锈钢组；E—纯铜组。在每个实验组的小鼠左侧大腿内侧肌肉内种植一种材料，对照组只进行切开缝合，不放入种植材料。分别于术后1、2、3、4和6周每组各取7只小鼠眼眶静脉取血，作T淋巴细胞亚群检测。
1.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测方法
1.3.1将肝素抗凝血置于白细胞分层液上，分离出单个核细胞，经Hank's液洗涤及Tris－NH4Cl破坏红细胞，调整细胞浓度为1×107/ml。
1.3.2往Ependorff管中加入细胞悬液100μl,分别加入抗CD4、CD8单克隆抗体100μl（10倍稀释液），4℃放置40分钟，取出后离心洗涤，分别加入FITC标记的免抗大鼠IgG多克隆抗体100μl（10倍稀释液），置4℃40分钟。
1.3.3取出后再洗涤，滴片，双盲法于落射光荧光显微镜下计数荧光阳性细胞数，计算占全体淋巴细胞的百分率，共计数200个淋巴细胞。
2 实验结果
2.1 术后CD4阳性细胞率的变化结果
种植术后CD4阳性细胞率变化情况见表1。
表1 种植术后CD4（％）变化（ ±s）n=7
| 时间（周） |
A组B组C组D组E组 |
B组 |
C组 |
D组 |
E组 |
| 1 |
47.73±3.75 |
50.45±5.20 |
38.52±4.04△△** |
40.55±4.65△△** |
49.58±5.54 |
| 2 |
44.25±2.43 |
42.88±3.07 |
36.21±3.18△△** |
34.21±5.55△△** |
36.63±4.10△△** |
| 3 |
49.33±4.93 |
41.27±5.67△△ |
37.97±2.31△△ |
45.60±6.49 |
44.22±3.17△ |
| 4 |
48.31±3.37 |
44.33±3.20 |
44.0±11.19 |
44.66±3.38 |
42.63±4.46△ |
| 6 |
60.26±8.07 |
57.37±4.66 |
52.32±5.81 |
56.46±6.04 |
8.55±3.05△△** |
注：同A相比△P<0.05△△P<0.01同B相比＊P<0.05＊＊P<0.01
将每次测定结果对照组（A）的数值作参考值，设为100％，其他各材料组的数值同参考值相比较得出相对变化百分率，绘制成术后CD4阳性细胞率相对变化趋势，见图1。
图1 术后CD4（％）变化趋势
从以上图表中可以看出，种植术后各实验组的CD4值都有降低趋势。DLC－Ti只在术后第3周CD4降低明显，同对照组相比，差异非常显著（P<0.01)。DLC－Ti，随后逐渐上升，接近对照组水平，基本恢复正常。纯钛和医用不锈钢组在实验初期CD4值降低明显，且在1～2周内较DLC－Ti组降低非常显著（P<0.01)，实验后期虽较对照组和DLC－Ti组的CD4值降低，但统计学无意义，也基本恢复正常。纯钛组的CD4水平的降低程度同对照组和DLC－Ti组相比始终有明显差异（P<0.01)。
2.2 术后CD8阳性细胞率变化结果
从术后CD8阳性细胞率变化趋势图（图2）上可以看出，各实验组在术后第1，2周CD8都有所下降，3周以后逐渐上升，超过对照组水平，表现出术后初期1～2周典型的应激反应。B、C、D三组的CD8值在第3周以后同对照组相比无统计学意义，但B组的CD8值变化幅度相对较小，更接近正常水平。纯铜的CD8阳性细胞率的变化较明显，直至第4周时同A、B两组差异仍非常显著（P<0.01)见表2。
表2 术后CD8（％）变化（±s）n=7
| 时间(周） |
A组 |
B组 |
C组 |
D组 |
E组 |
| 1 |
8.59±2.13 |
8.15±1.91 |
7.74±2.73 |
7.95±3.52 |
6.36±1.28△* |
| 2 |
19.72±4.43 |
14.96±2.85△ |
14.69±2.32△ |
13.83±1.81△ |
13.37±5.90△ |
| 3 |
9.91±2.81 |
10.58±4.79 |
11.44±3.38 |
12.58±3.01 |
13.26±3.89 |
| 4 |
19.95±3.31 |
20.41±5.86 |
20.81±4.65 |
22.39±3.30 |
26.69±4.32△△** |
| 6 |
11.36±3.54 |
13.51±3.17 |
14.99±3.58 |
15.37±3.37 |
14.12±2.42 | 注：同A相比△P<0.05△△P<0.01同B相比*P<0.05**P<0.01
图2 术后CD8（％）变化趋势
2.3 术后CD4/CD8比值的变化结果
CD4/CD8比值是综合反应机体免疫系统状态的指标。从其结果可以看出，DLC－Ti的CD4/CD8比值在术后虽有变化，同对照组相比无统计学意义，说明DLC－Ti对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的平衡的影响不显著。而C、D组在第3周和第6周较对照组相比差异显著（P<0.05)，E组的变化更显著，见表3、图3。
图3 术后CD4/CD8比值变化趋势
表3 术后CD4/CD8比值变化（±s)n=7
| 时间(周) |
A组 |
B组 |
C组 |
D组 |
E组 |
| 1 |
5.91±1.72 |
6.35±1.79 |
5.42±1.51 |
6.07±2.89 |
7.93±1.03 |
| 2 |
2.38±0.69 |
2.94±0.50 |
2.54±0.52 |
2.61±0.60 |
3.18±0.19△ |
| 3 |
5.29±1.31 |
4.52±1.68 |
3.59±1.10△ |
3.76±0.75△ |
3.56±0.91△ |
| 4 |
2.48±0.44 |
2.31±0.54 |
2.16±0.27 |
2.05±0.24 |
1.64±0.18△△** |
| 6 |
5.73±1.83 |
4.40±0.81 |
3.68±1.03△ |
3.77±0.61△ |
3.14±0.47△△** |
注：同A相比△P<0.05△△P<0.01同B相比P<0.05P<0.01
3 讨论
作为医用材料生物相容性检测方法之一的细胞及体液免疫功能测定法，使人们从免疫学角度评价生物材料对机体的影响。1988年Loon等[6]在研究了接触镍后口腔粘膜周围T淋巴细胞亚群变化后，证明了镍对机体免疫功能有一定的抑制作用。王刚垛等[7]也证实了铅对机体体液免疫和细胞免疫功能有明显的抑制作用，T细胞亚群中以具有诱导和辅助功能的细胞亚群受抑制最明显。90年代后Burgepbuu和Matbeeba发现患者因接受种植材料不同，机体免疫状态也有不同程度的改变，且接受同一种植材料的患者术后免疫系统的改变也有差异，这种差异与术后并发症的发生率有关。因而术前、术后进行免疫学检查，可预测并发症的发生，及时进行相应的治疗，减少种植失败率，同时也可以检测不同种植材料对机体的影响，以利于对种植材料的优选。
T淋巴细胞不仅是细胞免疫功能的承担者，而且也是体内细胞免疫和体液免疫的调节者，具有免疫调节功能的T淋巴细胞中，首推辅助性T淋巴细胞（TH)和抑制性T淋巴细胞(Ts)。TH和Ts的相互诱导和相互制约所形成的T细胞网络，对于调节免疫应答和维持免疫自稳有其重要意义。TH细胞是抗体产生的辅助细胞，也是IL—2产生的主要来源。Ts细胞在免疫反应中起负向调节功能，Ts的缺损将导致免疫耐受消失或减弱。TH/TS比值的平衡是机体免疫系统处于正常状态的表现，TH/TS比值的异常，可以导致机体免疫系统的紊乱。
从本实验的结果可以看出，种植材料的植入，降低了TH细胞的数量，却增加了TS细胞的抑制功能，即对机体的免疫系统产生了抑制作用。DLC－Ti在实验的第2和第3周对TS细胞和TH细胞有抑制作用，之后对免疫系统无明显影响，在整个实验期间内TH/TS的比值始终未受明显影响，说明DLC－Ti对免疫系统无明显抑制作用，而纯钛在实验的第6周对机体的TH/TS平衡仍有明显抑制作用，进一步说明了涂覆DLC的钛复合体大大提高了纯钛的生物相容性。
DLC－Ti复合材料不仅具有良好的生物力学性能，同时也具有更好的生物相容性，由于DLC－Ti的制备在近室温下进行，这样低的制备温度即便DLC膜很薄（约1μm），也查不到涂层材料内部基材显示的毒性，这充分显示了DLC膜的优良生物相容性和较好的扩散阻挡层性质，此外由于该DLC膜与基材粘结强度较高，摩擦系数小，耐腐蚀，制备工艺简单，实用性好等优点，使它作为种植材料具有广泛的应用前景。 |
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