【摘要】 目的：了解合成的拟TGF-β样多肽P18对于成骨细胞株MC3T3-E1的增殖及分化的影响。方法：MTT法观察P18对于培养MC3T3-E1细胞株的增殖的影响，竞争性半定量RT-PCR了解其对1型胶原表达的作用，并观察了其对于成骨细胞碱性磷酸酶活性的作用。结果：P18增加成骨细胞株MC3T3-E1的I型胶原的表达，但对于碱性磷酸酶活性无明显影响，多肽对于MC3T3-E1细胞增殖的影响依培养条件不同而异。结论：P18对于成骨细胞的作用与TGF-β类似，由于其还具有HA结合活性，在HA骨修复材料的改进以及种植体涂层修饰方面有着广阔的应用前景。
　　骨组织在材料表面的形成依赖于成骨细胞的代谢和分泌。尽管对于骨源性细胞和材料的相互作用机制还不清楚，但是很明显：材料的表面性质决定了何种分子被吸附到其表面，这一吸附过程影响了随后的细胞行为和组织反应[1]。天然的反应并不代表最适反应，这一反应过程可以通过改变材料/骨界面之间的分子加以控制，从而调节成骨细胞的反应性。目前，已经有许多生物活性蛋白与种植材料吸附或与各类羟基磷灰石（HA）类骨修复材料复合的应用研究的报道，但是蛋白质和生物材料的吸附是一个复杂的过程，蛋白质在体内容易被蛋白酶降解而失活、天然蛋白质的免疫原性等原因限制了其临床应用，为此，我们参考国内外的研究资料，探索了合成多肽用于修复材料改进的可能性，本文主要讨论所合成的拟TGF-β样多肽P18对于成骨细胞系MC3T3-E1的影响。

材料和方法

1 材料
　　MC3T3-E1细胞株由军事医学科学院基础医学研究所提供。聚酰胺树脂及Sephadex G-15等购自Phamacia公司；9-芴甲基羰基（Fmoc）保护氨基酸为Biochem公司产品；逆转录试剂盒、对硝基酚磷酸酯（pNPP）及α-MEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；dNTPs、Taq酶购自华美公司；胎牛血清为Hyclone公司产品；Trizol、四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚枫（DMSO）为Sigma公司产品。其余均为国产AR试剂。
2 方法
2.1 多肽的合成及鉴定
　　合成的多肽分子序列为：ANVAENAPEEEEEEEE（P18），HA结合序列（E8）参考人骨唾液蛋白151-158位氨基酸保守序列；多肽的N-端序列为Cytomodulin[2]序列，中间以脯氨酸（P）相连。多肽的合成采用对碱不稳定的9-芴甲基羰基（Fmoc）保护氨基酸的α-氨基，采用对酸不稳定的叔丁基型或其它保护基团保护氨基酸的侧链官能团，用聚酰胺树脂作为多肽合成的固相载体[3]。所得粗肽经过sephadex G-15凝胶层析初步纯化，最后经过反向HPLC分析表明合成多肽的纯度为72.33%，合成多肽经过质谱鉴定表明分子量与预期值一致。
2.2 细胞培养
　　成骨细胞株MC3T3-E1培养于含有10%胎牛血清，维生素C 50μg/ml，青、链霉素各100IU/ml的α-MEM培养基，5%CO2，37℃培养至对数生长期后，0.25%的胰蛋白酶消化，800×g离心5分钟后，血细胞计数板计数后备用。
2.3 MTT法测定细胞增殖
　　采用MTT法[3]，104细胞/孔接种于96孔细胞培养板，37℃培养4小时后加入不同浓度的多肽分子，继续培养48小时后加入MTT（0.2mg/ml），37℃继续培养2小时，吸去培养基，加入150μl DMSO /孔，在Bio-tek EL311酶联仪上测定595nm吸光值。
2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性测定
　　根据Bessay[4]方法并加以微量化，简述如下：MC3T3-E1细胞按104/孔种于96孔细胞培养板，在不同实验条件下培养后移去培养基，PBS冲洗两遍，加入20m mol．L-1 pNPP(0.1% TritonX-100 PBS) 80μl，混匀，37℃孵温30分钟后加入20μl NaOH（5 mol．L-1），酶联仪测定405nm吸光值即为ALP相对活性。
2.5 提取总RNA
　　细胞按105/孔种于6孔细胞培养板，多肽处理后4小时提取细胞总RNA。提取总RNA经过甲醛变性胶电泳鉴定其质量。
2.6 引物设计
　　用GOLDKEY软件对于来自NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)的核苷酸序列库的大、小鼠的I型胶原(COLI)、 骨钙蛋白和b-acgin的序列进行分析，设计b-acgin正、反向引物分别是5’GAGAAG-TACTATGTTGC-3’，5’CGCAGCTCAGTAACA GTC-CGC-3’, 扩增产物长度为520bp; COLI正、反向引物分别是5’CACAGCTCAGTAACAGTCCGC-3’,5’CTCCGGCTCCTGCTC CTCTTA3’, 扩增产物长度为360bp。骨钙蛋白的正反向引物分别是5’ACCTAGCAGACACCATGAGGAC3’, 5’TCTGAA-CTTTTGGAG3’扩增产物长度为380bp。三对引物均为大、小鼠通用引物，经检验引物内部无发夹结构，引物之间无二聚体形成，引物与基因库之间无非特异性同源区域。
2.7 逆转录反应及PCR
　　逆转录反应按试剂盒说明进行。
　　PCR参考文献[5, 6]方法进行PCR，产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。

结果

　　1 P18对于成骨细胞增殖的影响依据培养条件的不同而产生不同的作用
　　P18对于成骨细胞系MC3T3-E1增殖的影响（图1）表现为在无血清培养时，在多肽浓度 0-5ug/ml范围内表现为促进增殖的作用，高于此范围时随着多肽浓度的增加细胞增殖受到抑制。在2.5%血清存在时，P18的浓度0-15ug/ml范围内表现为促进增殖的作用，高于此范围时随着浓度的增加细胞增殖受到抑制，其促进增殖作用增强而抑制增殖的作用减弱。在10%血清存在时，P18作用表现为促进细胞增殖。

图1　不同培养条件下P18 对于MC3T3-E1
细胞增殖的影响

　　2 P18增加COL1的表达
　　采用敏感、特异并可定量检测基因表达的方法竞争性RT-PCR检测COLI的表达，选择在大多数细胞内均为高表达的β-actin作为内对照，凝胶电泳结果（图2A）经扫描后用图象分析软件计算COLI/β-actin的比率，结果表明P18能够显著增加COLI的表达量，并表现为一定的剂量效应。

图2　PCR 产物凝胶电泳图谱
M.PCR 标志物，由上而下片段大小分别为2kb、1kb、750bp、
500bp、250bp、100bp;1,3,5为对照组，2 为20ug/ml P18 处理组;
4，6 为50ug/mlP18 处理组.

　　在本实验条件下，实验组与对照组均未检测到骨钙蛋白的表达（图2B）。
　　3 P18对于成骨细胞的ALP活性没有明显的影响P18对MC3T3-E1的ALP活性在本实验条件下未观察到明显的影响（图3）。在0-100ug/ml的范围内，细胞ALP活性没有明显的改变。

图3　P18 对于MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

讨论

　　MC3T3E1细胞系来源于新生小鼠颅骨，能够分化成成骨细胞并在体外矿化，关于该细胞株的形态等生物学特点已经比较清楚[7]，总的说来，该细胞属于尚未分化成熟的成骨样细胞。TGF-β是一个多功能的生长因子，参与体内多种病理和生理过程，并在创伤愈合、免疫抑制等方面具有重要的临床应用前景，局部或全身应用TGF-β已经被用于软组织修复、骨修复和缺血损伤修复[8]。由于天然蛋白的种种不利因素，我们根据自己的研究目的设计合成了一段新型TGF-β样多肽分子P18。
　　文献报道的TGF-β对于成骨细胞的体外作用一般为促进细胞增殖，本试验结果表明P18对于成骨细胞具有促进增殖的作用，但是其作用和血清的浓度有密切的关系，说明其和血清中的某些成分关系密切，这些血清成分有可能是纤维连接蛋白（fibronectin）等细胞外基质蛋白或者其它生长因子，是否天然TGF-β也存在这一现象目前还未见文献报道。
　　天然TGF-β对于成骨细胞ALP活性的影响和它促进细胞增殖的作用相反，即在促进增殖的条件下，TGF-β降低成骨细胞ALP活性，而在起抑制作用条件下却增加ALP的表达。P18在促进细胞增殖的条件下对于MC3T3-E1细胞的ALP活性并无明显影响，由于MC3T3-E1细胞株属于尚未分化成熟的成骨细胞，推测造成这一现象的原因可能与TGF-β协调细胞成熟分化作用有关。
　　COLI是成骨细胞分泌的主要基质蛋白之一，和天然TGF-β一样，P18能够明显增加COLI的表达，这一点对于其用途具有重要的意义，由于合成的P18还具有羟基磷灰石（HA）结合能力，可以吸附在HA表面而使材料表面的成骨细胞加速分泌细胞外基质并促进其增殖，使材料和骨组织之间迅速达到生物结合。本实验条件下未观察到骨钙蛋白的表达，这可能由于MC3T3-E1细胞是一种尚未分化成熟的细胞，而骨钙蛋白主要在成骨细胞分化成熟的晚期表达。
　　P18对于成骨细胞的作用与天然TGF-β相似，由于它还具有天然TGF-β所没有HA结合能力，在HA类骨修复材料的改进以及种植体涂层修饰方面有着广阔的应用前景。