【摘　要】　　目的：探讨RA与midkine (MK)基因 表达在牙胚发育过程中的相互关系。方法：将16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于含不同浓度的外源性RA（分别为5×10 -8 ，5×10-7 和5×10-6mol/L）的 RPMI 1640半固态培养基表面 。培养2d后分别提取总 RNA，经 RT-PCR 扩增25个循环，采用 Southern 印迹法检测MK mRNA 在牙胚组织中的表达变化。结果：体外培养2d后，对照组（无 外源性 RA ）牙胚MK mRNA 的表达为弱阳性；随培养基中外源性 RA浓度的增加，牙胚组织中 MK mRNA 的表达逐渐增强。结论：MK基因在牙 胚发育中的作用可能受RA 调控。

　　　　牙齿发育异常是临床上常见的牙体非龋性疾病， 与遗传、营养以及 某些药物的作用有关。维甲酸（retinoic acid, RA）是维生素A在体内代谢后的 主要活性产物。作为一种脂溶性类固醇激素，RA可直接与细胞核内的维甲酸受体结合，通过 激活核内维甲酸受体而发挥生物学作用［1］。以往研究表明，RA是维持胚胎正常发 育 以及人体正常功能所必需的成分之一。RA缺乏可妨碍鼠磨牙牙胚冠部形态的正常发生以及组 织细胞的分化，但RA调控牙胚发育的分子机制仍然不清［2，3］。mid kine (MK)在胚胎发育的中期呈一过性表达［4］，具体功能尚不清楚。在牙胚发育 过程中，MK在牙胚组织中分布广泛；阻断MK表达，可抑制牙胚正常形态发生和组织细胞的分 化［5］。本研究旨在通过观察RA对钟状期早期的鼠磨牙牙胚MK mRNA表达的诱导 ，探讨RA与MK 在牙胚发育过程中的相互关系。

1　材料和方法

　　本实验所用昆明小鼠由第四军医大学动物实验中心提供。小鼠胎龄以交配后次日见到阴道栓 的时间为0d。将胎龄为16d的昆明小鼠断颈处死，浸入750ml/L(v/v)乙醇中消毒15s。取胎 鼠下颌骨，体式显微镜下于Hanks液(含青霉素100U/ml, 链霉素100μɡ/ml)中分离下颌第一 磨牙牙胚。牙胚在预冷至4℃的Hanks液中充分洗涤后, 置于含不同浓度外源性RA (全反式； 5×10-8，5×10-7 和5×10-6mol/L)的RPMI 1640半固态培养基(含 100ml/L胎牛血清，50U/ml青霉素, 50μɡ/ml链霉素, 200μɡ/ml维生素C, 5g/L琼脂)表 面,以无外源性RA的培养基作为对照,于37℃,含50ml/L CO2的恒温恒湿培养箱中继续培养4 8h。 培养结束后分别用TRIzol RNA提取试剂盒(GIBCO)提取总RNA;用RT-PCR试剂盒(GIBCO)扩增25 个循环(具体操作步骤依据试剂盒要求进行),同时以肌动蛋白(actin)为内参照cDNA。采用So ut hern印迹法(探针为Digoxigenin标记的寡核甘酸探针)检测MK mRNA在体外培养牙胚组织 中的表达变化。

2　结果

　　Southern印迹的图像密度分析结果显示：在无外源性RA的培养基中，MK基因在牙胚组织 中呈弱表达；当外源性RA以不同浓度加入培养基后，MK基因在牙胚组织中的表达随培养 基中RA浓度的增加（5×10-8，5×10-7和5×10-6mol/L） 明显 增强（图1）。

图1　维甲酸诱导鼠磨牙牙胚MK基因表达的研究
E/C表示图像密度分析的灰度值之比　 E：实验组　 C：对照

3　讨论

　　MK作为一种肝素结合(heparin-binding)生长因子，在胚胎发育的中期发挥多方面的生 物学功能，如调节细胞的增殖与分化等。在牙胚发育过程中，MK基因呈时空表达：在牙 胚发育的早期阶段，MK基因主要在牙乳头细胞中表达；当牙胚的硬组织开始形成之后， MK基因在牙乳头细胞中的表达逐渐降低；将抗MK抗体加入培养基中，可抑制牙胚正 常形态的发生和组织细胞的分化，表明MK是牙胚早期发育所必需的生长因子之一。RA是 一种类固醇激素，与细胞 核内的维甲酸受体结合后，通过激活核内维甲酸受体而发挥生物学作用，是牙胚正常形态发 生和细胞分化所必需的成分之一。
　　牙胚发育是一个连续的生物学过程，小鼠磨牙牙胚的体外培养是研究这一生物学过程的良 好模型［6］。16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚处于钟状期早期，MK基因在牙胚 组织，尤其在牙乳头细胞中表达广泛；而维甲酸受体（RARs）在钟状期早期的牙胚组织中也 有广泛分布。因此采用钟状期早期的小鼠磨牙牙胚研究RA与MK基因表达的相互关系比较 适宜。
　　在牙胚发育过程中，MK与RA有某些相似的生物学功能，均可诱导牙胚形态发生和组织 细胞分化，但在牙胚发育过程中RA与MK基因表达的相互关系仍不十分清楚。我们的研究 结果显示，随外源性RA浓度的增加，MK基因在牙胚组织中的的表达逐渐增强，表明外源 性RA能够诱导牙胚组织中MK基因的表达。我们还发现在无外源性RA 的培养基中MK 基因仍有弱表达，表明MK不仅受RA调控，还可能受到其它一些未知因子的调控。

　　本研究的结果提示在牙胚发育过程中MK基因的作用受RA调控。