【摘　要】　　目的：克隆小鼠釉丛蛋白(tuftelin)成 熟肽编码区基因。方法：设计引物，以小 鼠牙胚cDNA文库为模板，利用PCR方法，扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段(约1200bp) ，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌XL-1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组 质粒DNA，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-tuftelin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结 论：克隆到小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。

　　成熟釉质中无机物占总重量的98%以上，是人体组织中矿 化程度最高的 组织。但发育中的釉质富含蛋白质和水,釉质基质蛋白可分为两大类：疏水的釉原蛋白(amel ogenin，AMG)，占90%，是发育中釉质基质蛋白的主要成分，在釉质矿化和成熟中起着控制 矿 化晶体的大小和形态的作用［1］。而酸性釉蛋白（enamelin），占10%，包括釉丛蛋 白 （tuftelin）、成釉蛋白(ameloblastin)等，在釉质矿化起始阶段起到矿化结晶成核的作用 ［2］。本组采用PCR技术克隆小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA，为表达该蛋白和研究 其生物学效 应打下基础。

1　材料和方法

1.1　PCR扩增和cDNA合成
　　根据MacDougall等［3］报道的小鼠tuftelin的cDNA序列，采用PCGENE设计PCR扩 增的两条引物：

　　5' GACCTCCGCGTGAAGATGAACG
　　3' AGGACTGAGGCAACTGCAACGG

　　以BALB-C小鼠牙胚cDNA文库为模板，PCR扩增出小鼠tuftelin成熟肽基因片段 （美国MJ Research 公司PTC—150型PCR仪）。Taq Plus II DNA聚合酶购于Sangon公司。
1.2　PCR产物的克隆及酶谱分析
　　用Klenow片段（Promega公司）补平PCR产物，对载体质粒pBS用SmaI酶切消化，将 补平的P CR产物以及经SmaI消化的pBS(pBluescript II KS) 共同在10g/L低熔点琼脂糖凝胶 上电泳回收，平端连接目的基因和载体，转化大肠杆菌XL-1-Blue，蓝白斑筛选阳性克隆p BS-tuftelin。碱裂解法提取重组质粒DNA。用EcoRI单酶切和XhoI，BamHI双 酶切以及PC R鉴定筛选到的阳性克隆。
1.3　核苷酸序列分析
　　用M13-20 Primer 为引物对克隆的tuftelin基因进行测序(Pharmacia T7 Sequence Kit )。

2　结果

2.1　PCR产物以及pBS-tuftelin重组质粒鉴定结果（图1）

图1:PCR产物tuftelin以及pBS-tuftelin重组质粒鉴定结果
　　1:Marker (λDNA经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切)
　　2:载体质粒pBS(2.9kb)
　　3:目的产物tuftelin(1.2kb)
　　4:重组质粒pBS-tuftelin(4.1kb)
　　5:pBS-tuftelin经EcoRⅠ酶切(3.8kb, 0.3kb)
　　6:pBS-tuftelin经XholⅠ,BamHⅠ双酶切(2.9kb, 1.2kb)
　　7:以pBS-tuftelin为模板的tuftelin PCR 产物(1.2kb)
　　8:阴性对照（未加pBS-tuftelin模板）
　　9: Marker (λDNA经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切)

　　从小鼠牙胚cDNA文库可扩增出大小约1.2kb的产物（3道），将此DNA片段插入 pBS后所 得重组质粒的大小约4.1kb（4道）。重组质粒经EcoRI单酶切后为两条带：3.8kb和0.3k b（ 5道）；经XhoI和BamHI双酶切后为两条带（6道）：2.9kb（与pBS电泳条带2道平齐 ）和1.2kb（与PCR产物电泳条带3、7道平齐）。以重组质粒为模板也可扩增出大小为1.2k b的特异产物(7道)。以上结果与预期的完全一致。
2.2　pBS-tuftelin重组质粒的序列分析
　　釉丛蛋白成熟肽编码区基因克隆重组质粒pBS-tuftelin部分核苷酸序列测定，可读出的 200多个碱基序列与报道的结果完全一致。

GAGCGGCGAC ACCAGTCAGA CCGTGTGGCC TTTGAGGTCA
CACTCAGCCG TTATCAGCGA GAAGCAGAAC AGAGTAATGT
GGCCCTTCAG AGAGAGGAGG ACAGAGTGGA GCAGAAAGCG
GCAGAAATCG AGGAGCTACA GAGGCGCTTG CTGGGGATGG
AGGCGGAGCA TCAGGCCTTA CTGGTGAAAG TCAGGGAAGG

3　讨论

　　发育阶段的釉质富含基质蛋白，大致可分为富含脯氨酸的釉原蛋白和酸性的釉蛋白。目前已 知的釉蛋白主要有成釉蛋白和釉丛蛋白，前者在釉质矿化中起支架作用，后者起成核作用。 釉原蛋白的基因位于性染色体上，可能与性连锁的遗传性釉质发育不全（占遗传性釉质发育 不全的10%）有关。近来的研究指出，釉丛蛋白的基因位于1号常染色体q21-23位点，推测与 占 遗传性釉质发育不全的90% 的常染色体连锁的釉质发育不全有关［1,2］。研究釉丛 蛋白的基因结构和功能，对探明此类疾病的发病机理有重要意义。
　　目前已克隆了牛、鼠釉丛蛋白基因的cDNA序列，人和猪的部分序列。牛釉丛蛋白基因的序列 分析表明：由于mRNA转录过程中的选择性剪切，该基因有4种不同的转录本，最长的转录本 为2674bp，含13个外显子，另外3种转录本分别缺少第2、第5、第6外显子［4］。小 鼠 釉丛蛋白cDNA序列含2572bp，5'非翻译区含22bp，23～1192为成熟蛋白编码区。本实 验根据 已报道的小鼠釉丛蛋白cDNA序列设计引物，从小鼠牙胚cDNA文库中扩增出了1.2kb大小的特 异片段，经过克隆、酶切、PCR鉴定及序列分析，证明已得到小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDN A片段，为该基因的表达、蛋白质功能的研究奠定了基础。