摘要 目的:本实验旨在建立一套提取和鉴定粘性放线菌菌毛的方法。方法:采用粘性放线菌变异株5519(1+2-)和5951(1-2+)分别提取Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。首先用机械搅动法分离菌毛与菌体,进一步用凝胶过滤柱层析提取、纯化两种菌毛,并通过电镜观察和对流免疫电泳进行初步鉴定。结果:证实分别提取到Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。结论:两种菌毛的提取为进一步分析研究它们的生化特征和生物活性奠定了基础。

　　粘性放线菌(以下简称粘放菌)与龋病(尤其是根面龋)以及牙周病的发生均有关［1,2］。其致病作用的首要条件是它对宿主的粘附和定居。众多研究结果表明［3,4］,粘放菌表面的菌毛与粘放菌的粘附有关。粘放菌有两种功能及抗原性不同的菌毛:Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。随着对粘放菌粘附机理的深入研究［5,6］,认为菌毛上存在与粘附有关的蛋白质,即粘结素。目前,对粘放菌菌毛上粘结素的结构与成分尚不清楚。为了深入研究两种菌毛的生物性能,以及菌毛上的粘结素,提取粘放菌菌毛成为研究的起点。目前,国内尚未见这方面的报道。本实验旨在建立一套提取和鉴定粘放菌菌毛的方法。

1 材料和方法
1.1 实验材料
　　粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二医科大学口腔医学研究所刘正教授惠赠。抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗体由美国Florida大学Nesbitt教授惠赠。凝胶过滤柱Sepharose 6B由美国Sigma公司提供。
1.2 细菌的培养和收集
　　选用胰蛋白胨大豆琼脂(TSB)非选择性厌氧菌培养基。37℃厌氧培养(80%N2,20%CO2),经形态染色、生化鉴定及血清学鉴定符合标准后,纳入实验菌株。根据两种菌毛的生物学性能的差异,确定5519只有Ⅰ型菌毛,5951只有Ⅱ型菌毛。
　　将粘放菌5519、5951分别接种于TSB固体培养基上,37℃厌氧培养48小时,用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)洗下平板上的细菌,分别离心收集两种细菌(3000 r/min,10分钟),再加入0.01 mol/L PBS缓冲液。
1.3 菌毛的分离
　　参照机械搅动法［7,8］分离菌毛与胞壁。在4℃冰箱内,磁力搅拌器搅拌菌悬液5分钟,4℃高速离心(12000×g,20分钟),收集上清液。将细菌沉淀按上述过程再处理1次。合并2次离心的上清液,为菌毛粗提物。
1.4 菌毛的提纯
　　用20%饱和硫酸铵沉淀上清液［4,9］,4℃高速离心(16000×g,30分钟),沉淀用少量0.01 mol/L PBS缓冲液溶解,并用相同的缓冲液反复透析2天,收集蛋白溶液,即为初步纯化菌毛。贮存于-20℃冰箱内备用。
　　预先用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)平衡Sepharose 6 B柱。将1.5 ml初步纯化菌毛蛋白上样,用同样缓冲液洗脱(5 ml/h),收集样品(2 ml/管)。紫外线分光光度计测定每管OD280 nm值,计算机绘制洗脱图谱。合并电镜观察到含有菌毛的组分,即为部份纯化菌毛。冷冻干燥。
将部份纯化菌毛溶于1.0 ml缓冲液中,再次上样,按上述方法经Sepharose 6 B柱层析进一步分离纯化。
1.5 菌毛的鉴定
1.5.1 电镜观察 参照Clark等、刘正等［10,11］介绍的方法观察菌毛在处理前后的细菌表面及不同阶段提取物中存在与否。
1.5.2 免疫学鉴定 采用对流免疫电泳法鉴定。抗原为Ⅰ型或Ⅱ型菌毛的粗提物、部份纯化菌毛和纯化菌毛。抗体为抗Ⅰ型菌毛或抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗体。

2 结 果
2.1 菌毛的提取结果
　　粘放菌5519、5951培养48小时后,电镜观察可见菌体表面有长短不一的菌毛(图1)。机械搅动2次后,菌体表面菌毛基本消失,菌体完整(图2)。说明本实验采用的方法使菌毛与菌体间有最大程度的分离。

图1　粘性放线菌菌体表面有长短不一的菌毛
a.粘放菌5519　EM ×60000
b.粘放菌5951　EM ×25000

图2　粘放菌机械搅动后菌体表面菌毛消失，菌体完整
a.粘放菌5519　EM ×40000
b.粘放菌5951　EM ×40000

　　粘放菌5519的菌毛粗提物FI经Sepharose6B第1次柱层析分离得到2个洗脱峰(图3),电镜观察到第1个峰F(I,1)有菌毛;粘放菌5951的菌毛粗提物FⅡ经柱层析也有2个洗脱峰(图4),第1个峰F(Ⅱ,1)有菌毛。

图3 粘放菌5519菌毛粗提物FⅠ的Sepharose6B柱层析图谱
1 F(Ⅰ,1),2 F(Ⅱ,2)

图4 粘放菌5951菌毛粗提物FⅡ的Sepharose 6 B柱层析图谱
1 F(Ⅱ,1),2 F(Ⅱ,2)

　　部份纯化菌毛F(Ⅰ,1)和F(Ⅱ,1)分别经Sepharose 6 B再次分离纯化(图5,6)。因为F(Ⅰ,1)和F(Ⅱ,1)经过冷冻干燥,对菌毛的形状有影响,所以电镜观察再次纯化的洗脱峰,未见明显的菌毛。

图5 F(Ⅰ,1)的Sepharose 6 B柱层析图谱 A F(Ⅰ,1,1)

图6 F(Ⅱ,1)的Sepharose 6 B柱层析图谱 B F(Ⅱ,1,1)

2.2 免疫学鉴定结果
　　Ⅰ型及Ⅱ型菌毛提取物的对流免疫电泳结果见图7,8,结果说明FⅠ、F(Ⅰ,1)、F(Ⅰ,1,1)中含有Ⅰ型菌毛;FⅡ、F(Ⅱ,1)、F(Ⅱ,1,1)中含有Ⅱ型菌毛。

图7　Ⅰ型菌毛提取物的对流免疫电泳实验
A：粗提物F1　　　B：部分纯化物F(Ⅰ,1)
C：纯化物F(Ⅰ,1,1)　　D：抗Ⅰ型菌毛抗体

图8　Ⅱ型菌毛提取物的对流免疫电泳实验
A：粗提物FⅡ　　　B：部分纯化物F(Ⅱ,1)
C：纯化物F(Ⅱ,1,1)　　D：抗Ⅱ型菌毛抗体

3 讨 论
　　分离并提取完整而纯化的菌毛是深入研究粘放菌菌毛生物性能的关键。为此,国外许多学者采用了不同的方法分离和提取粘放菌菌毛。归纳步骤为:细菌培养,菌毛的分离,菌毛的初步提纯和进一步提纯及鉴定。
　　菌毛的分离是一项关键步骤。总结国外已采用的菌毛分离方法,有4种:匀浆法［8］,French压榨机压挤法［9,10］,酶解法和超声法［4］。本实验结合匀浆法［8］以及牙龈类杆菌等细菌菌毛的分离法［7］,采用机械搅动法分离菌毛与胞壁。仪器要求不高,操作简便。细菌经过2次处理后,电镜观察菌毛有最大程度的分离。这一结果与Masuda等［8］实验结果一致。
　　本实验采用Sepharose 6B凝胶过滤层析对菌毛进行分离纯化。凝胶过滤是根据蛋白质的分子大小不同进行分离。凝胶过滤具有分离条件温和,实验重复性高,完成操作时间相对较短等优点。本实验通过2次柱层析以分离纯化菌毛。含菌毛的洗脱峰出现位置与国外同样条件下洗脱图谱上菌毛出现的位置基本一致［8］。
　　研究早期,国外通过电镜观察到菌毛,没有细胞、细胞器及碎片［4,8,10,12］。当制备出抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的抗体后,则采用免疫学方法鉴定［10,13］。本实验结合上述两种方法,首先电镜观察处理前、后粘放菌表面菌毛存在的情况,确定菌毛已脱落。进而,通过电镜观察确定部份纯化组分F(Ⅰ,1)和F(Ⅱ,1)含有菌毛。免疫学鉴定则确定再次纯化得到的洗脱峰F(Ⅰ,1,1)、F(Ⅱ,1,1)分别含有Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛,同时证实粗提物、部份纯化组分中含有菌毛。比较两种鉴定方法,电镜观察直观,但国内存在价格高,仪器技术条件不稳定等因素的影响。免疫学鉴定准确简便,但国内尚需制备出抗两种菌毛的抗体。
　　关于Ⅰ型菌毛、Ⅱ型菌毛的提取,Cisar等［14］用粘放菌T14V作为抗原,制备出抗Ⅱ型菌毛的单克隆抗体。Cisar和Clark等［1,9］偶联此单克隆抗体制备一个亲和层析柱,从而分别收集到Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。此外,也可通过只有Ⅰ型菌毛和只有Ⅱ型菌毛的变异株来分别提取Ⅰ型或Ⅱ型菌毛［15,16］。本实验采用后一种方法提取到Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛,为进一步分析研究两种菌毛的生化特征和生物活性奠定了基础。