【摘要】　目的　明确金黄色葡萄球菌能否侵入体外 培养的人成骨细胞，并比较三个不同菌株在侵入能力上的差异。方法　采用三个不同的金黄色葡萄球菌菌株(6571、8325-4和WA250)，取半对数生长期细 菌用于实验。成骨细胞培养自健康成人拔下颌阻生齿手术中之去骨块。侵入实验的细菌与细 胞比例为30：1，侵入发生时间为2小时，细胞外细菌为庆大霉素杀灭。部分被感染的成骨细 胞溶解后用于细菌培养，计算菌落数；部分送电镜观察。结果　6571 菌株对成骨细胞每孔的平均侵入菌落数为1976±269；8325-4为2856±493；WA250为5638±3 81。电镜观察显示，三株均有侵入成骨细胞现象，以WA250侵入最多，其次分别为8325-4和6 571。结论　金黄色葡萄球菌能侵入成骨细胞内，其侵入能力与菌株 本身特点有关。金黄色葡萄球菌侵入成骨细胞后能逃避庆大霉素的杀菌作用,这可能与临床 上骨髓炎不易为抗生素治愈有关。
　　【关键词】　金黄色葡萄球菌　　成骨细胞　　侵入

　　金黄色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要来源，约 有65%～70%的骨髓炎由金黄色葡萄球菌引起［1，2］。金黄色葡萄球菌的表面相关蛋 白 能强有力地刺激骨吸收，抑制骨胶元合成［3，4］。但是有关金黄色葡萄球菌如何引 起骨感染目前仍所知甚少。最近，有研究表明金黄色葡萄球菌能侵入某些体外培养的宿主细 胞，如成纤维细胞、鼠的肾细胞、内皮细胞等［5］。金黄色葡萄球菌的这种侵入真 核细胞的能力可能与其引起骨髓炎的病理机制有关。本文的目的在于明确金黄色葡萄球菌是 否能侵入体外培养的成骨细胞，并比较三个不同菌株在侵入能力上是否存在着差异。

材料和方法

　　细菌培养：金黄色葡萄球菌6571为本实验室所用之标准菌株，8325-4源自经前 噬菌体处理的NTCC8325，agr(accessory gene regulator)阳性，WA250是8325-4的变异株， agr A基因插入Tn551.三个菌株均保存在Willkins-Chalgren琼脂上，于实验开始前2.5 小时在Wilkins-Chalgren液体培养基内培养，并让其生长进入对数生长期。取半对数生长期 细菌用于实验，并用分光光度计测定细菌浓度。细菌以200×g离心10分钟，去上清液，用培 养液DMEM(GIBCOL公司)混匀。
　　成骨细胞培养：人成骨细胞培养自健康成人阻生齿拔除手术中的去骨块。成骨细胞培养方法 同Beresford等人所采用的方法［6］。将骨块上骨膜及纤维性组织完全剔除，剪成直 径3～5mm的细块，用PBS洗去骨髓组织及积血，然后置入75mm培养瓶内，加入DMEM培养液(GI BCOL公司)。培养液含25mM Hepes，100单位/ml-100微克/ml的青-链霉素，10%胎牛血清和2m M L-谷氨酰胺。细胞在37℃、95%空气-5%CO2环境中培养。成骨细胞形态由相差显微镜确 定，碱性磷酸酶活性由组织化学方法［采用 alpha-naphtyl phosphate(Sigma)］证实。取 原代成骨细胞用于侵入实验。
　　侵入分析：将成骨细胞用0.25%胰蛋白酶(GIBCOL公司)处理后，计数，按每孔5×104 个细胞密度加入24孔培养板中过夜。次日，用上述准备好的细菌以MOI为30的比例加入细菌( 1个细胞比30个细菌)后置于摇摆板上，在37℃环境中孵育2小时。2小时后用DMEM液洗涤成骨 细胞，后每孔加入每毫升含100微克庆大霉素(Sigma)的DMEM 1毫升，并继续在37℃环境中培 养2小时。在此期间所有在细胞外的细菌将为庆大霉素杀灭。2小时后仍用DMEM液洗涤成骨细 胞三次，用0.1%三硝基甲苯X-100溶解成骨细胞，取溶解液在Wilkins-Chalgren琼脂培 养基上培养，次日计算菌落数。所有的实验均三份进行，并分别重复三次。
　　庆大霉素的杀菌能力：为确证庆大霉素能完全杀死细菌，按侵入实验中相同的方法，在每孔 中加入相同的细菌数(1.5×106)及1毫升含100微克庆大霉素的DMEM，在37℃环境中孵 育2小时，后取样在Wilkins-Chalgrenp琼脂培养基上培养。
　　电子显微镜观察：用于电子显微镜观察的侵入实验在8室载玻片上进行。每室细胞数为2.5 ×104，其余同上述的侵入实验，但不经0.1%三硝基甲苯X-100处理。被感染的成骨 细胞在0.2M的二甲胂酸钠缓冲液(SCB)(pH7.4)中用3%戊二醛固定，室温下过夜。标 本在SCB中洗涤三次，然后在室温下于SCB中用1%OsO4再固定2小时，继用SCB洗涤，后经脱 水包埋于Epon812。用Leica Ultracut-S超薄切片机制作超薄切片(90nm)，切片用2%乙酸双 氧铀和醋酸铅染色，philips CM-10透射电镜下观察并摄片。

结　　果

　　三株金黄色葡萄球菌对成骨细胞的侵入能力：6571菌株对成骨细胞每孔的平均侵 入菌落数为1976±269；8325-4为2856±493；WA250为5638±381。
　　电子显微镜观察结果：三株菌株均见有侵入成骨细胞现象，以WA250侵入最多，其次为8325- 4，6571较少(图1、2、3)。

图1　WA250侵入成骨细胞最多，黑箭头示细菌将细胞膜溶解，
即将移出成骨细胞(×9800)

图2　8325-4也有较多侵入(×7000)

图3　6571侵入较少，白箭头示细菌位于空泡内(×9800)。
金葡菌的直径约1μm。

　　庆大霉素的杀菌作用：所有经庆大霉素处理的细菌均未见菌落生长，表明在此2小时期间庆 大霉素可完全杀灭与其培养的细菌。

讨　　论

　　本实验的初步研究结果明确显示三株不同的金黄色葡萄球菌均能被体外培养的人 成骨细胞所摄入。致病菌要侵入宿主细胞首先必须附着于宿主细胞上。大多数金黄色葡萄球 菌能产生菌壁相关蛋白，如蛋白质A、胶元结合蛋白、纤维粘连素结合蛋白等［7］。 这些蛋白能和许多宿主细胞的基质蛋白、细胞粘连分子结合。对成骨细胞而言，可能作为金 黄色葡萄球菌表面蛋白受体的物质有骨钙素、osteonectin、bone sialoprotein、整合蛋白 等［8］。三株不同金黄色葡萄球菌菌株中WA250侵入细胞的能力最强。WA250是8325- 4的变异株，agrA基因为Tn551插入。agr能控制金黄色葡萄球菌许多蛋白毒素、酶和细胞表 面蛋白的转录和翻译，对前二者的作用是增强，对后者的作用是减弱［9］。WA250在 合成蛋白质A和凝固酶上的能力比8325-4高出10倍，并能结合更多的纤维粘连素［7］ 。这可能与其侵入成骨细胞能力强有关。进一步的研究可采用抑制或增强上述各种蛋白质作 用的手段来探明它们对金黄色葡萄球菌侵入宿主细胞的确切作用。
　　几乎所有的致病菌在侵入细胞后都首先进入有膜包被的空泡中，随后发生如下变化：①有些 致病菌能在与溶酶体融合后的空泡内继续繁殖，其机制尚不明；②有些能使其所处空泡不与 溶酶体发生融合；③有些则把空泡溶解后生存在胞浆内［10］。从本实验的电镜观察 结果看，侵入成骨细胞内的金黄色葡萄球菌有些为空泡包裹(图3)，有些游离于胞浆中。这 是否表明金黄色葡萄球菌进入成骨细胞后先是在空泡中，然后将空泡溶解而游离于胞浆中尚 需进一步研究。
　　一般而言，当致病菌在宿主细胞内活跃繁殖时，宿主细胞即被溶解死亡。引起细胞破坏的主 要原因是致病菌毒素；另外，目前不少研究认为某些致病菌能使某些细胞发生凋亡［10 ］。本组实验中，电镜下可见有些细胞胞膜溶解，细胞内的金黄色葡萄球菌似从溶解的胞 膜突破口处涌出(图1)，但未见任何细胞凋亡的形态学改变，如染色质固缩、断裂，凋亡 小体形成等。细胞凋亡的整个过程大约持续数分钟至数小时［10］。本实验用于电镜 观察的成骨细胞和金黄色葡萄球菌作用时间共4小时。作者推测，金黄色葡萄球菌在本实验 条件下可能不会引起成骨细胞凋亡，所观察到的成骨细胞胞膜溶解可能为金葡菌的毒素所致 。
　　庆大霉素是杀菌性抗生素，不能透过真核细胞膜［11］。本实验证实了这一点，同时 也说明：①电镜中观察到的成骨细胞内的金黄色葡萄球菌确实存在于成骨细胞内；②进入成 骨细胞的金黄色葡萄球菌得到了成骨细胞的保护，从而免遭庆大霉素的杀灭。这可能是临床 上有些骨髓炎患者长期使用抗生素治疗无效的原因之一。