摘要　目的：建立免疫功能正常小鼠肾囊膜下移植舌癌模型。材料和方法：利用SRCA技术，建立移植舌癌模型，观察移植前后瘤体大小的变化，并对移植瘤进行病理切片观察。结果：舌癌移植后第6天瘤体增长率为87.8%(7/8)(P＜0.05)，病理切片证实其为高分化性鳞癌。结论：小鼠肾囊膜下移植舌癌模型的建立具有可行性，它可为舌癌的基础与临床研究提供一个经济、快速、高效的动物模型。
关键词　小鼠　肾囊膜下　舌癌模型

　　舌癌是常见的口腔恶性肿瘤，国内学者报道其发病率已居口腔恶性肿瘤的第一位［1］。因此，舌癌的防治在口腔肿瘤防治的研究中占相当重要的地位。
　　利用动物复制舌癌模型，是研究舌癌防治的重要手段，但目前常见的以裸鼠为复制对象的舌癌皮下、原位等模型［2］，存在饲养条件要求高、耗时长、花费大等不足。1978年Bogden 首先建立了人体肿瘤块裸鼠肾囊膜下移植法(Subrenal Capsule Assay, SRCA), 随后又成功地把这一方法应用于免疫功能健全的小鼠［3］。但国内外尚未见小鼠肾囊膜下移植舌癌模型建立的报道。
　　本研究旨在建立一种全新的舌癌模型，为舌癌的防治提供一个简便、经济、快速、实用的动物模型。　　

材料和方法
　　1. 试剂：RPMI1640培养基(GIBCO产品，USA)。
　　2. 实验动物：BALB/c纯系小鼠，雌性6只，8周龄，20～21g；雄性2只，8周龄，22g。湖北省医学科学院实验动物中心提供。小鼠置于通风、干燥环境，清洁饮水，纯系鼠料喂养。
　　3. 仪器：游标卡尺(精确度0.02mm)，广西桂林量具刃具厂。
　　4. 模型建立方法：
　　(1) 将手术切除之舌癌标本漂洗后，于无菌操作台上剪成直径约1.5mm大小之瘤块，置于RPMI1640培养液中，4℃冰箱存放备用。
　　(2) 小鼠腹腔注射2%戊巴比妥纳麻醉。
　　(3) 小鼠取俯卧位，常规消毒后从一侧肾脏部位平行脊椎切开一约7mm的切口，打开腹腔托出肾脏。
　　(4) 以血管钳或眼科镊轻提肾囊膜，以16号套管针将舌癌组织小块接种于肾囊膜下。
　　(5) 以游标卡尺测量瘤体长径(L)、宽径(W)，计算瘤体大小(TS)：TS=(L+W)/2。
　　(6) 还纳肾脏于腹腔，分层缝合腹膜、肌层及皮肤层。
　　(7) 术后常规肌注青霉素3天。
　　(8) 术后第6天处死小鼠，打开腹腔，以游标卡尺测量瘤体长径与宽径，计算瘤体大小(TS)：TS=(L+W)/2。
 
　　(9) 计算瘤体前后大小之差△TS:△TS=TS末-TS初。
　　5. 对瘤体前后大小的变化结果用t检验进行统计学处理。
　　6. 小鼠一般情况的观察：包括饮食、活动情况、被毛、体重等。
　　7. 移植舌癌的组织病理学观察：处死小鼠后，将荷瘤肾固定于4%多聚甲醛中性固定液中，梯度酒精脱水、二甲苯透明，常规浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜下观察。　　
结　果
　　移植后第六天处死小鼠后测瘤体大小(TS)，发现除一例略缩小外，其余均呈不同程度增大，增长率为87.8%(7/8)(见附表)。统计学处理表明，移植前后瘤体大小的增加有显著性(P＜0.05)。
　　

附表　移植舌癌瘤体大小变化(△TS) 

BALB/C 小鼠	△TS(mm)
	正增长	负增长
雌性(6只)	0.7，0.37，0.03，0.89，0.27	-0.02
雄性(2只)	0.1，0.84

t检验，P＜0.05

　　
图1　瘤体中央有角化囊形成，瘤体边缘与肾皮质间有较多淋巴细胞浸润。
HE染色　　　　×25×3

　　
图2　癌细胞局限于肾囊膜下，排列呈巢状及不规则条索状，可见核分裂相。
HE染色　　　　×100×3

　　荷瘤肾的组织病理学切片光镜下可见瘤体中央有角化囊形成，癌细胞局限于肾囊膜下，排列呈巢状及不规则条索状，癌细胞呈多边形或不规则形，胞核大、深染，可见核分裂相，瘤体边缘与肾皮质间有较多淋巴细胞浸润(图1、图2)。
　　术后至处死前，小鼠活动良好，饮食正常，被毛无异常，体重无减轻。　　

讨　论
　　自Bogden首先建立人体肿瘤块裸鼠肾囊膜下移植法(SRCA)， 随后又成功地把这一方法应用于免疫功能健全的小鼠以来，学者们对该方法及其应用进行了广泛而深入的研究。
　　与常规接种瘤组织选用的皮下组织相比，肾囊膜下具有毛细血管丰富，各种营养物质和药物容易弥散、吸收的特点。其次，肾脏为免疫排斥反应迟发性脏器，依免疫排斥反应发生的规律，宿主对移植物短期内不易产生明显的排斥反应［4］。
　　为了延迟排斥反应的发生，一些学者采用了一些抑制免疫反应的措施［5，6，7］，如注射环孢素A、环磷酰胺，射线照射等，但这些人为外加因素又使SRCA结果的分析复杂化。另外，多数学者的研究也表明，SRCA6天法是可取的［4］。本研究的结果也证实了这一点。
　　本研究利用SRCA6天法，进行舌癌组织块移植，结果显示，BALB/c小鼠肾囊膜下舌癌移植后瘤块的增长率为87.8%(7/8)(P＜0.05)，且瘤组织切片光镜下可见大量癌细胞，证实其为高分化鳞状细胞癌。这表明本研究中小鼠肾囊膜下舌癌移植的成活率达到87.8%。为了提高移植的成功率，我们认为要做到以下几点：① 取材时要避开肿瘤坏死部分，准确取材，并在制备好的瘤块中随机选数块作组织学检查以作为质量控制的参数；② 尽量缩短从肿瘤取材到植入的时间；③ 手术操作宜轻柔，切忌损伤肾实质，以免大量渗血将移植物带出肾囊或造成粘连。
　　作为化疗药物检测的一种方法，SRCA的理论优势在于［8，9］：同裸鼠皮下移植模型一样，它利用的是第一代人肿瘤移植块，与自身供体肿瘤更接近；保持了细胞膜的完整性、细胞与细胞间的接触；维持了肿瘤内在的空间联系。对于检测存在异质细胞的实体肿瘤的药物活性而言，这些都是十分重要的因素。这也为SRCA的抗肿瘤药物敏感性研究提供了理论依据。
　　对于SRCA结果与临床反应的相关性，Griffin等［9］评价了1000例肿瘤移植物对药物的敏感性， 其真阴性率达94%， 真阳性率达82%。 在37例晚期或有明显转移而不适宜于其它方法治疗的肿瘤患者中，用SRCA实验结果指导医生用单剂药物治疗，结果14例获完全或部分缓解。这表明SRCA实验结果与临床治疗、预后的相关性非常显著。
　　综上所述，免疫功能正常小鼠肾囊膜下移植舌癌模型的建立具有可行性，它将为舌癌的研究提供一个经济、快速、高效的动物模型，并将在舌癌的研究尤其是临床抗舌癌药物的筛选中具有较好的应用前景。