[摘要] 目的 探讨外源野生型PTEN抑癌基因对人高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭特性的影响。方法 用脂质体介导方法将FrEN抑癌基因导人M3SP2细胞系(M3SP2—PTEN细胞)，转染空载体的细胞系作为对照(M3SP2—pBp细胞)，分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、细胞迁移试验及细胞侵袭试验测定M3SP2—PIEN细胞和M3SP2—pBp细胞体外黏附、迁移和侵袭能力。结果 M3SP2—PTEN细胞在Metrigel和Fn基质上黏附数量减少，与对照组比较差异有显著性(P<0．01)，黏附抑制率分别为34．3％和49．4％。M3SP2—PTEN细胞在Matrigel基质上迁移距离小，与对照组比较差异有显著性(P<0．05)，迁移抑制率为26．0％。M3SP2—PTEN细胞体外侵袭细胞数量减少，与对照组比较差异
有显著性(P<0．01)，侵袭抑制率为31．4％。结论 外源性PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭具有抑制作用。
[关键词] PTEN抑癌基因；黏液表皮样癌
FTEN(phosphatase and tensin homology deleted On chromosome 10，PTEN)基因是近年来发现的一种新的抑癌基因，许多研究表明，将野生型PTEN基因导人脑胶质瘤、子宫内膜癌等恶性肿瘤细胞，产生显著的抑癌效应「1,2」，有望成为治疗肿瘤的候选基因。黏液表皮样癌是一种常见的涎腺恶性肿瘤，其中低分化型肿瘤具有侵袭性强、转移率高、预后差的特点「3」。本实验首次探讨外源性野生型PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭的影响。
1 材料和方法
1．1 材料
人工重构基膜材料Matrigel(美国C0llaborative Rsearch公司)，纤维连接蛋白(Fn，美国Sigma公司)，小牛血清白蛋白(BSA，华美生物工程公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，96孔培养板(丹麦NUNC公司)，用于细胞侵袭试验的培养小室Transwell(孔径8 um，美国Costar公司)。
1．2 方法
1．2．1 基因转染及细胞培养 参照文献[4]，用脂质体介导方法将含野生型PTEN抑癌基因逆转录病毒载体导入内源野生型PTEN抑癌基因表达缺失的M3SP2细胞系(简记为M3SP2—PTEN细胞)，转染逆转录病毒空载体的细胞系作为对照(简记为M3SP2—pBp细胞)。细胞用体积分数为10％胎牛血清的RPMl l640培养液(美国Gibco公司)，在37℃、体积分数为5％ C02及饱和湿度条件下培养。
1．2．2 细胞黏附试验 参照文献方法并加以改良「5，6」，主要实验步骤如下：将10 g／L BSA、50mg／LMetrigel l：8稀释液以及10 mg／L Fn分别以50 ul/孔各自加入96孔培养板，4℃包被基膜过夜。次日水化基膜，即吸出残余液体，每孔加入50 ul含10 g／LBSA的无血清培养液，37 ℃孵育1 h。消化M3SP2—pBp细胞和M3SP2—PTEN细胞，以1X10 5／mL细胞密度，分别将100 uL细胞悬液接种于包被BSA、etrigel和Fn的96孔培养板中，每组平行4个样本。用含10 g／L BSA和体积分数为1％胎牛血清的RPMl l640培养液分别在37 ℃培养1 h后，按MTT比色法测定各孔细胞的吸光度值(A值)，以BSA组贴壁细胞A值为参照，分别按公式计算Metrigel和Fn组中M3SP2—pBp和M3SP2—FFEN细胞黏附率。以对照细胞M3SP2—pBp为参照，分别计算M3SP2—PTEN细胞在人工基膜Metrigel和Fn上的黏附抑制率。
黏附率(％)=[(实验组细胞A值／BSA组细胞A值)—1]x100。
黏附抑制率(％)=[1—(M3SP2—PTEN组黏附率／M3SP2—pBp组黏附率)]x100。
1．2．3 细胞迁移试验 参照文献方法并加以改良「7」，主要实验步骤如下：在96孔培养板中包被Metrigel，方法同细胞黏附试验。以5X10 5／ml细胞密度，分别将100uL M3SP2—pBp细胞和M3SP2—PTEN细胞悬液接种于包被Metrigel的96孔培养板中，每组平行4个样本，用体积分数为10％胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养，直至形成细胞单层。在培养板底部单层培养细胞上呈“一”字形划痕，用无血清培养液洗涤1次，更换含10g／L BSA和体积分数为1％胎牛血清的RPMl 1640培养液，然后，显微镜下测量划痕区相对距离。培养24 h后，更换体积分数为10％胎牛血清的RPMl 1640培养液，继续培养24 h后，显微镜下测量细胞向致伤区迁移的相对距离。根据原始细胞致伤区距离计算出细胞实际迁移距离。以M3SP2—pBp细胞为对照，按公式计算M3SP2—FYEN细胞迁移抑制率。
迁移抑制率(％)=[1—(实验组迁移距离／对照组迁移距离)]x100。
1．2．4 细胞侵袭试验 参照文献方法并加以改良进行「5,6」，主要实验步骤如下：用含10％胎牛血清的RPMl 1640培养液常规培养NIH3T3细胞系制备条件培养，即在细胞长势良好情况下换无血清培养液继续培养24 h，然后收集培养上清液，过滤除菌，冰冻保存备用。用50 mg／L Metrigel l：8稀释液包被Transwell小室底部，4 ℃风干。同细胞黏附试验水化基膜，将Transwell小室放人24孔培养板中，在小室外加入400 ul按1：1混合的条件培养液和完全培养液；在小室内加入100 ul M3SP2—pBp或M3SP2—PTEN细胞悬液，细胞数为1 X 10 5，培养液为含10 g／L BSA和体积分数为1％胎牛血清的RPMI l640培养液。每组重复4个样本。常规培养48h后，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，950 ml／L乙醇固定，4 g／L锥虫蓝溶液染色。在倒置显微镜下放大150倍计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野。以M3SP2—pBp细胞为对照，按公式计算M3SP2—PTEN细胞侵袭抑制率。
侵袭抑制率(％)=1［1-(实验组细胞数／对照组细胞数)]x100。
1．3统计学方法
应用SPSS统计软件进行t检验。
2 结 果
2．1 外源性PTEN基因对黏液表皮样癌细胞体外黏附的影响
Metrigel和Fn基质具有促进肿瘤细胞黏附的作用，转染PTEN抑癌基因则显著减少M3SP2—PTEN细胞在基质表面上的黏附，见表1。
表1 M3SP2—pBp和M3SP2—PTEN细胞在不同基质上的黏附(％)
与对照组比较，* *P<0．01
2．2 外源性PTEN基因对黏液表皮样癌细胞体外迁移的影响
M3SP2—pBp细胞在Matrigel基质上的迁移为(258．8±19．5)um，M3SP2—PTEN为(1931．3±24．4)um，，M3SP2—PTEN细胞在Matrigel基质上的迁移受到抑制，抑制率为26．0％，P<0．05。
2．3 外源性PTEN基因对黏液表皮样癌细胞体外侵袭的影响
M3SP2—pBp侵袭细胞数为109．0±17．7，M3SP2—PTEN为74．8±15．7，M3SP2—PTEN细胞侵袭Ma-trigel基质的能力降低，抑制率为31．4％，P<0．01。
3 讨 论
黏附、基质降解和运动是肿瘤细胞侵袭的3个环节。肿瘤细胞通过膜表面特定受体与基质或基膜的层黏连蛋白(1amini，LN)、Fn和Ⅳ型胶原等黏连，然后肿瘤细胞可释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原，使基质成分降解，最后肿瘤细胞运动并充填到被水解了的基质空隙处，如此3个过程不断重复，肿瘤细胞则不断向深层侵袭。肿瘤细胞的黏附能力与运动能力也有密切关系，肿瘤细胞之间的同质性黏附降低有利于肿瘤细胞脱离瘤母体。与LN、Fn和Ⅳ型胶原及内皮细胞等异质性黏附促进了肿瘤细胞的侵袭「8」。
PTEN对黏液表皮样癌细胞系黏附能力的抑制作用：肿瘤细胞通过膜表面受体(integrins、cad-herins和laminin受体等)黏附于基膜及细胞外基质的成分Fn、LN和Ⅳ型胶原蛋白上。细胞的黏附性能在维持细胞外形、调节细胞分裂、运动等功能中起重要作用。黏附是癌细胞侵袭的始动步骤。高侵袭的肿瘤细胞与基膜成分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的同质性黏附能力会下降。上述特性有利于肿瘤细胞与肿瘤母体分离，并侵犯基膜等正常组织。本实验结果显示，将外源性PTEN导人黏液表皮样癌细胞能降低癌细胞在Matrigel和Fn基膜上的黏附，黏附抑制率分别为34．3％和49．4％，表明外源性PTEN具有抗黏附作用。
PTEN对黏液表皮样癌细胞系迁移能力的抑制作用：肿瘤细胞与母体瘤分离，穿越血管壁，侵袭周边正常组织时，需要一定的运动能力。高转移的肿瘤细胞通常具有较强的运动性。细胞外基质成分Fn、LN和一些生长因子对肿瘤细胞有趋化作用，可使其发生定向运动。Tamura等「7」应用体外划痕实验证实，转染磷酸酶活化形式的PTEN抑癌基因能显著抑制胶质瘤细胞U87MG的迁移，而转染磷酸酶非活化形式的PTEN对细胞迁移没有影响。Liliental等「9」报告，PTEN缺失导致细胞运动性增加，当重新导人野生型PTEN能明显降低细胞运动性。本实验应用体外划痕实验模型测定癌细胞在人工基膜Ma－trigel上的迁移能力，结果显示表达外源性PTEN基因的M3SP2—PTEN细胞在Matrigel基质上的迁移受到明显抑制，抑制率为26．0％，表明外源性PTEN具有抗迁移作用。
PTEN对黏液表皮样癌细胞系侵袭能力的抑制作用：在肿瘤转移形成过程中，肿瘤细胞侵袭基膜是重要环节。Matrigel是从小鼠EHS肉瘤细胞系中提取的基质成分，含有LN、Ⅳ型胶原等，铺在Transwell侵袭小室的滤膜上，能在培养基中重组形成与天然基膜相似的膜结构。具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可穿过滤膜。Koul等「10」将野生型PTEN重新导人胶质瘤细胞U251，诱导细胞出现anoikis(凋亡的另一种形式，即细胞脱离基质所产生的凋亡)，并显著抑制细胞体外侵袭，抑制率达70％。本实验结果显示，表达外源性PTEN基因的M3SP2—PTEN细胞对人工基膜的侵袭能力显著下降，侵袭抑制率达31．4％，表明外源野生型PTEN抑癌基因具有抗侵袭作用。 |
.text:''):(d.getSelection?d.getSelection():'');void(keyit=window.open('http://my.poco.cn/fav/storeIt.php?t='+escape(d.title)+'&u='+escape(d.location.href)+'&c='+escape(t)+'&img=http://www.h-strong.com/blog/logo.gif','keyit','scrollbars=no,width=475,height=575,status=no,resizable=yes'));keyit.focus();){kind=logo}
中“PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响”相关内容
中“PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响”相关内容
中“PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响”相关内容
中“PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响”相关内容
中“PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响”相关内容
中“PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响”相关内容