【摘要】　目的　探讨紫外线照射对抑癌基因P53表达 的影响。方法　以P53基因功能正常的舌癌细胞株为靶细胞，用不同 剂量的紫外线照射或相同剂量紫外线照射不同时间后，采用免疫沉淀法检测P53基因表达水 平的变化。结果　紫外线照射可诱导P53基因过度表达。P53基因的过 度表达在紫外线照射后可持续相当长一段时间。结论　外源性DNA损 伤因子可诱导P53基因表达；P53基因过度表达可能是细胞对外源性DNA损伤因子造成细胞基 因组DNA损伤的一种功能性反应。
　　【关键词】　紫外线　　抑癌基因P53　　过度表达

　　对正常口腔粘膜、癌前病变及口腔癌中P53基因表达研究发现，正 常口腔粘膜中基底细胞偶见P53阳性染色细胞，在单纯上皮增生到不同程度非典型上皮增生 中P53阳性细胞数量增多、范围扩大。在阳性染色舌癌中侵袭性强的肿瘤细胞几乎均为P53 阳性染色，肿瘤侵袭前沿细胞几乎均有P53基因的过度表达［1］。这些结果提示P53 基因的过度表达不一定意味着伴有P53基因的突变。P53基因的过度表达有时可能是对细胞环 境的一种反馈调节，是P53基因正常生物学功能的一种体现。
　　为进一步探讨P53基因的过度表达与细胞微环境的关系，本研究采用紫外线照射舌癌细胞Tca 83来分析紫外线对P53基因表达水平的影响。

材料和方法

　　一、细胞培养
　　舌癌细胞株Tca83(北京医科大学口腔医学院口外研究室惠赠，该细胞株P53基因未发生突变) 在RMPI1640培养基，15%牛血清，100u/ml青霉素G，100μg/ml链霉素，5%CO2，饱和湿度 条件下培养。当细胞生长铺满90mm培养皿面积的90%时用胰酶消化，将1×10细胞接种于35mm 培养皿中，培养2天。
　　二、紫外线照射、同位素标记
　　1.吸除培养液，将培养皿中细胞在紫外线下分别照射5、10、15、20、30分钟。照射后加入 含有25uCi/ml 35S标记甲硫氨酸的RMPI1640培养基培养2小时。吸除培养液，用PBS洗涤细 胞，培养皿中加入1ml PBS，将细胞刮下，移入1.5ml离心管中，离心收集细胞，吸去上 清，将细胞沉淀储存于-20℃冰箱中备用。
　　2.吸除培养液，将培养皿中细胞在紫外线下照射20分钟。加入完全培养基，在培养30、60、 90、120、180、240、360分钟时吸去培养液，加入含有25uCi/ml 35S标记甲硫氨酸培养液 标记30分钟，PBS洗涤细胞，将细胞刮下移入1.5ml离心管中离心收集细胞沉淀，沉淀于 -20℃冰箱中备用。
　　三、细胞提取物制备、免疫沉淀、SDS-PAGE、放射自显影。详细实验步骤参见《分子克隆》 ［2］。

结　　果

　　本研究用免疫沉淀法分析了紫外线照射对P53基因表达的影响。不同的紫外线照射 剂量(照射5、10、15、20、30分钟)均对P53蛋白表达水平产生影响，表现为P53蛋白表达水 平的显著提高(图1)。分析了相同照射剂量(20分钟)不同时间后(10、15、30、60、90、120 、180、240、360分钟)P53蛋白表达水平的变化，发现在紫外线照射后360分钟仍然可检测到 P53基因的表达(图2)。说明P53基因的过度表达可能是对紫外线对细胞基因造成损伤的一种 功能反应。

图1　紫外线照射舌癌细胞Tca83对P53基因表达的影响
1、2、3、5、7为照射5、10、15、20、30分钟后P53蛋白表达水平；4、6为Tca83 对照。

图2　紫外线照射Tca83后不同时间P53表达水平分析
　　1、2、4、6、7、8、9、10分别为照射后15、30、60、90、120、180、240、360分 钟时P53表达水平。3、5为Tca83对照及空白对照。

讨　　论

　　P53基因在细胞周期循环中发挥重要作用。P53基因的异常表达已成为判断肿瘤预 后的一种标志。将野生型P53基因作为恶性肿瘤转基因治疗的首选基因已在人体多种组织来 源的肿瘤细胞株中进行了试验。初步研究结果显示野生型P53基因在不同程度上抑制了恶性 肿瘤细胞的生长。由此可见，抑癌基因P53这条通道是否通畅对细胞正常生长和增殖至关重 要。我们对口腔癌、癌前病变中P53基因表达研究中发现P53基因过度表达并不只局限于肿瘤 细胞，在正常或单纯上皮增生和基底细胞中亦存在过度表达。这提示我们P53基因的过度表 达可能与细胞受到外因刺激有关。本研究采用紫外线照射舌癌细胞Tca83，结果发现P53基因 表达明显提高，P53基因过度表达在紫外线照射后360分钟时仍然可以检测到。此结果一方面 说明紫外线照射可诱导P53基因过度表达，另一方面提示P53基因的表达可受外界因素影响。 但这种影响产生的机理尚不清楚。众所周知，紫外线照射可诱发皮肤癌，原因是紫外线可导 致细胞DNA损伤。P53基因的过度表达可能是对细胞DNA损伤的一种反应。即P53启动细胞DNA 修复系统使损伤DNA得以修复，以维护细胞基因组DNA的完整性。
　　研究发现一些DNA肿瘤病毒，如SV40、腺病毒、HPV病毒的大T抗原、EIB蛋白、E6蛋白可与P5 3蛋白形成复合物，这些蛋白与P53的结合是病毒进行自我复制所必需的过程［3］。S V40大T抗原与P53蛋白结合后使P53半衰期明显延长；腺病毒EIB蛋白与P53蛋白结合的结果使 P53蛋白快速降解；HPV16 E6蛋白亦具有此种特性。这些病毒基因产物与P53蛋白结合本质上 都是阻断P53调控细胞周期的同一个通道，使细胞生长失去控制发生转化甚至恶变。与其他 致突因子在本质上是不相同的。在DNA病毒感染的细胞中常会发现P53基因过度表达现象，这 也可能是P53基因拮抗病毒使细胞转化的功能体现。
　　在头颈部肿瘤中P53基因的过度表达常与P53基因突变密切相关。研究发现P53基因突变在头 颈部癌中主要以点突变或缺失常见。阐明P53基因突变或缺失的原因对癌的预防和治疗具有 深远意义。目前，有关这方面的研究还不多。通过分析作者认为生物因素，如病毒感染等造 成P53基因突变或部分基因的缺失的可能性极小。我们推测某些物理和化学因素可能是造成P 53基因突变的主要原因。如紫外线、电离辐射和化学诱变剂(如烟草等)均能造成DNA损伤。 这些因素造成的DNA损伤主要形式是碱基更替(点突变)、丢失、DNA骨架中磷酸二脂键断裂、 碱基间交联等。这些DNA损伤重者将导致细胞死亡或恶性转化。本研究间接证明紫外线照射 可造成细胞DNA损伤，而细胞DNA的损伤诱导P53基因的过度表达。P53基因过度表达的生物学 效应是使细胞进入G1期，使损伤的DNA有充分的时间进行修复。如果紫外线照射使P53基因亦 发生突变，无疑就丧失了对细胞周期的调节功能，意味着细胞可能发生恶性转化。皮肤癌中 P53基因突变率很高，可能与紫外线照射关系密切。
　　研究表明发生于口腔粘膜的鳞状细胞癌P53突变与吸烟关系密切。在动物实验中还发现DMBA 诱导的金黄地鼠舌癌中P53基因发生点突变。此外，一些化学物质可诱导ras基因突变［ 4］；在NMBA(N-nitrosomethylbenzylamine)诱导的兔食道乳头状瘤中P53基因发生点突变 ［5］，这些结果提示某些口腔癌的发生与化学因素有关。口腔作为上消化道入口， 每天均遭受多种化学、物理及生物因素的刺激，其中某些致癌物质可能会对口腔粘膜细胞基 因组DNA造成损伤，导致P53基因的过度表达。当这些损伤累及到P53基因时，很可能会通过 阻断P53基因抑癌通道而发生恶性转化，最终发展成肿瘤。由此可见抑癌基因P53在口腔癌发 生中可能扮演着十分重要的角色。