【摘要】　目的　检测涎腺腺样囊性癌对抗癌药物的 敏感程度。方法　采用MTT法测试了14种抗癌药物对SACC-83、ACC-2 和ACC-M等3个体外培养的涎腺腺样囊性癌细胞株的杀伤作用强度。结果　3种细胞株对14种药物的敏感性大体相似而又有差别，在抗代谢类抗肿瘤药物中，对MT X、DNR、ADM、5-Fu、MMC的敏感性较强，在植物来源的抗癌药物中，对Taxol有明显的敏感 性。结论　药物敏感性测定对临床选用有效的治疗涎腺腺样囊性癌药 物具有一定的价值。
　　【关键词】　腺样囊性癌　　化学敏感试验　　MTT分析法

　　腺样囊性癌是涎腺常见的恶性肿瘤，在手术治疗的同时，应用化疗 药物对提高治疗效果及防止远隔脏器转移具有重要意义。但由于药物选择性差，同时由于肿 瘤病理组织学分型、生长方式及分化程度不同，对各种化疗药物的敏感性也存在着差异。为 了更有效地应用已知的抗癌药物，预测腺样囊性癌对药物的敏感性，指导临床治疗以提高疗 效，我们选用了3种腺样囊性癌实体瘤细胞株，用MTT(四氮唑盐)法进行了肿瘤细胞体外药物 敏感性试验。

材料和方法

　　1.细胞系：人涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83为本院建立，ACC-2及高转移细胞 株ACC-M引自上海第二医科大学口腔医学院。常规培养于含15%小牛血清的RPMI-1640培养液 中。
　　2.化疗药物及浓度设定：ADM(阿霉素，意大利 FARMI TALTR CRRLOERBALtd生产)；CDDP(顺 铂，山东德州制药厂生产)；5-Fu(5-氟尿嘧啶，上海旭东海普药业有限公司生产)；DNR(柔 红霉素，意大利FARMITALIA CARLO ERBA 生产)；MMC(丝裂霉素，日本协和发酵工业株式会 社生产)；MTX(氨甲蝶呤，上海华联制药有限公司生产)；Ara-C(阿糖胞苷，上海华联制药有 限公司生产)；PYM(平阳霉素，天津市河北制药厂生产)；VCR(长春新碱，上海华联制药有限 公司生产)；HRT(三尖杉脂碱，北京协和药厂生产)；HPT(羟基喜树碱，黄石飞云制药有限公 司生产)；Taxol(紫杉醇，中国医学科学院药物研究所提供)；Vp-16(鬼臼乙叉甙，北京制药 工业研究所实验药厂生产)，榄香烯乳(大连金港制药有限公司生产)。以上14种药物根据抗 肿瘤药体外实验用常用参考浓度［1］及参考下述公式推算 ［2］：
　　
　　每种药物设置4个浓度。
　　3.药物敏感性MTT测定法：将处于指数生长期的肿瘤细胞加入适量Trypsin-EDTA液，使贴壁 细胞脱落配成悬液，按每孔2×103个(100μl)接种于96孔平底培养板中，将平板置37℃、 5%CO2、100%湿度培养箱中24小时后，加入含有不同浓度受试药物的培养液100μl，每个 药物不同浓度设平行的三个孔，对照组加不含药物的培养液100μl，再放入培养箱中孵育72 小时，用快速翻板法倒掉培养液，每孔加入用无血清1640按0.4μg/ml配制的MTT溶液10 0μl，温育4小时，使MTT还原为甲月　替，再次倒 掉上清液，每孔加DMSO(二甲基亚枫)150μl，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪(日本产，BID -RAD550型)在570nm波长处测定、打印每孔的OD(光密度)值。
　　4.统计分析：各药物等级重复孔计算OD值均数，并按以下公式计算抑制率：
　　
　　用krber法计算出各种药物的细胞半数抑制浓度(IC50)；
　　根据临床每日常规用药剂量按以下公式计算出体外试验用药物浓度［3］：
　　体外试验药物浓度(μg/ml)=(50×D)÷5000÷50%×103；
　　D：临床用药剂量(mg.kg-1/day)，按每毫升含细胞培养液加50μl体外试验药物浓度 计算剂量。临床用药剂量参照文献［1］，取静脉注射用量的平均值。
　　体外试验药物浓度＞IC50为敏感；体外试验药物浓度＜IC50为不敏感或耐药， 并计算出二者的比值(敏感强度)。

结　　果

　　一、抗癌药物对三个细胞株的抑制作用：根据OD值求出药物对癌细胞的抑制率， 并计算出IC50值(表1)。

表1　14种抗癌药物对三个细胞株的杀伤作用

药物	IC50(μg/ml)
	SACC-83	ACC-2	ACC-M
ADM	0.172	0.385	0.355
CDDP	0.794	0.687	0.618
5-Fu	0.474	0.321	0.460
DNR	0.036	0.047	0.036
MMC	0.100	0.054	0.047
MTX	0.007	0.008	0.060
Ara-C	6.262	6.220	13.373
PYM	0.809	0.684	0.370
VCR	0.008	0.056	0.057
HRT	0.548	0.412	0.456
HPT	0.050	0.461	0.518
Taxol	0.001	0.003	0.004
Vp-16	10.008	12.797	13.614
榄香烯乳	32.278	21.487	24.897

二、腺样囊性癌三个细胞株对14种抗癌药物的体外试验用剂量的敏感性(表2) 。 表2　14种抗癌药物体外试验用剂量对三个细胞株的药敏感性

讨　　论

　　Mosmann最早报告了应用多孔扫描分光光度计(Elisa Reader)可精确测定细胞的生 长及存活，并用于药物对细胞的杀伤效果研究［4］。MTT化合物中与细胞作用的主要 成份四氮唑盐(Tetrazolium salt)是一种能接受氢原子的染料。活的肿瘤细胞线粒体中与辅 酶Ⅱ(NADP)相关的脱氢酶在细胞内可将黄色、水溶性的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲月　替(formazan)，而死的细胞则无此功能。用DMSO将甲月　替溶解后，在570nm的波长下用酶标仪测定OD值，即可测 出存活细胞数。以同一样品的不同药物浓度对细胞存活率作图可得到剂量反应曲线，从中可 求出药物在不同杀伤程度时所需要的剂量。肿瘤细胞系MTT法药物敏感分析人为误差小而较 精确，结果与3H-TdR掺入法等化学敏感性试验结果有较好的一致性［5］，且 不需要放射性同位素。
　　在新的抗肿瘤药物的体外筛选中，合成化合物或植物提取物纯品的IC50＜10μg/ml或 植物粗提物的IC51＜20μg/ml则可判定样品在体外对细胞有杀伤作用［2］， 在已知常用药物的剂量依赖性杀伤效应中，半数抑癌率剂量也可以反应出各种药物杀伤效应 的差别。因为各种化疗药物的作用机制不同及临床用药剂量存在着差异，所以我们以临床化 疗时应用的剂量为基础，用公式计算出体外试验时相对应的药物敏感检测用剂量，同时比较 了其与IC50的关系，即计算出敏感强度，力求反应出在临床允许的药物剂量时，各种 受试药物对腺样囊性癌的抗癌效果。
　　在14种抗癌药物对三个腺样囊性癌细胞系的药敏测定中，可以看出以下几个特点：①在7种 抗代谢抗肿瘤药物中，有5种达到有效杀伤浓度，按药敏强度分析依次为MTX、DNR、ADM、5- Fu和MMC。②在6种植物来源的抗癌药物中，以Taxol的杀伤效果最明显。③被测试的3个细 胞系药敏性大致相似，但将每个细胞系对14种抗癌药物的反应按敏感强度区分，又可得到不 同的序列，表明同一种肿瘤的不同细胞系中存在着异质性。在本实验中，测定了几种近年来 出现的植物来源的抗癌药物对腺样囊性癌细胞的杀伤效果，其中包括紫杉醇、三尖杉脂碱、 鬼臼乙叉甙和榄香烯乳等，其中效果最引人注目的是紫杉醇。紫杉醇是由短叶红豆杉树皮中 提取的复杂二萜类化合物，其作用机理与其它抗癌药物完全不同，它促进微管蛋白的聚合， 抑制其解聚，使细胞周期移行阻断在G2+M期，对抗药的人卵巢癌、乳腺癌及黑色素瘤有突 出的疗效，并对多种移植性肿瘤有明显的抑制作用，被誉为“九十年代发现的最主要的抗癌 新药”［6］。更可喜的是，近来有研究表明，紫杉醇和三尖杉酯碱对恶性肿瘤细胞 侵袭和运动也有明显抑制作用［7］，是一种有前景的抗肿瘤转移药物。
　　根据文献资料及化疗经验，Suen等(1982)提出CDDP、ADM、5-Fu对腺样囊性癌等较敏感，全 国涎腺肿瘤协作组也建议对其采用PVF方案。对比看来本试验结果与临床实际应用情况并不 全一致，这更进一步说明药敏试验的必要性；另一方面，此研究结果尚需经临床进一步验证 ，以确定其实际治疗效果。众所周知，目前临床使用的抗肿瘤药物均有较严重的毒副作用， 由于肿瘤存在着个体差异性及原发、继发的抗药性，即使同一组织学类型，分化程度相同的 肿瘤，也可以对同一药物的敏感性不同。因此，如果能够在化疗以前预先测定药物敏感性而 排除无效药物，就具有重要意义。近年来应用显示出与临床有较好相关性的应用人类新鲜癌 组织的体外药敏试验，可以有效地应用化疗药物，预测个体肿瘤对药物的敏感性［8］ ，并用于指导临床治疗，以提高疗效。国内外已有学者将其作为常规性工作［9，10 ］，值得进一步研究、应用。