【摘要】　目的　研究BMP2 mRNA 在颌骨骨肉瘤及软 骨肉瘤中的扩增及其对肿瘤预后和增殖活性的影响。方法　应用 BMP 2 的 cDNA探针，原位杂交检测 mRNA 的扩增。结果　32例标本中有2 1例表达BMP2 mRNA，有BMP2 mRNA表达的病例更容易发生淋巴结转移，且有较高增殖活性。 结论　BMP2 可能在骨肿瘤的发生和发展过程中起一定作用，可以作 为估计骨肉瘤预后的参考指标。
　　【关键词】　骨肉瘤　　软骨肉瘤　　骨形成蛋白

　　骨肉瘤和软骨肉瘤为恶性程度非常高的骨肿瘤，目前尚无较好指标 判断骨肉瘤的生物学特征及其预后。骨形成蛋白(Bone morphegenetic proteins,简称BMPs) 最早由骨肉瘤的基质中提取，有报道提示BMP在骨肿瘤中有较高表达并影响其临床和预后。 我们利用BMP2的cDNA探针，检测其mRNA在颌骨骨肉瘤中的表达，并结合临床资料，探讨表 达与肿瘤预后肿瘤增殖活性之间的关系。

材料和方法

　　一、标本来源
　　所有标本来源于第四军医大学口腔医学院手术切除并经病理诊断证实为骨肉瘤和软骨肉瘤的 标本(1996年～1997年)。总例数为32例，骨肉瘤24例，软骨肉瘤8例。上颌骨标本18例，下 颌骨标本14例。患者平均年龄26.5岁。标本中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续组织切 片，厚度5μm。
　　二、原位杂交
　　1.探针的制备：重组质粒PSP64-BMP2由美国基因研究所Wozney博士馈赠，将上述重组质粒转 化感受态细胞JM109，经扩增、质粒提取及酶切鉴定后，参照地高辛标记检测试剂盒(德国Bo ehringer Mannheim公司)说明对探针行随机引物法标记。
　　2.原位杂交检测：切片经梯度酒精处理入DEPC水及0.1mol/L的PBS，0.2mol/L HCL 和蛋白酶K处理(20μg/ml)，0.2%的甘氨酸终止反应，0.4%的多聚甲醛固定 ，经0.1mol/L PBS洗后梯度洒精脱水室温干燥，探针(2μg/ml)97℃变性10min后杂交(4 2℃，20h)。切片分别用2XSSC、1XSSC、buffer1、buffer3洗，正常羊血清封闭30min后，以 标记碱性磷酸酶的地高辛检测系统检测。实验设去除探针的空白对照和经RNA酶处理的消化 对照，阳性对照为经过反复检验的骨肉瘤标本。
　　3.免疫组化PCNA的单克隆抗体为PC10，购自DAKO公司，工作浓度为1：50。ABC试剂盒购自Ve ctor公司。常规免疫组化方法染色，DAB显色。PCNA表达的骨肉瘤标本为阳性对照，以PBS代 替一抗作阴性对照。PCNA的阳性反应为细胞核的棕黄色着色。BMP和PCNA反应的阳性判断标 准为高倍镜(×40)中有10个以上的阳性细胞。PCNA的阳性反应分级参照文献［1］

结　　果

　　一、提取质粒DNA酶切鉴定
　　PSP64-BMP2由3.0kb的载体和1.58kb的BMP2cDNA组成。提取的质粒DNA 经ECORI酶切 后得到两个片断，与λDNA/HinⅢ maker比较后，确定含有BMP2cDNA片断。
　　二、原位杂交检测结果
　　BMP2的杂交阳性标准为细胞浆中的深蓝色的细颗粒。略去探针的空白对照未见阳性信号，RN A酶消化后阳性信号明显减弱。24例骨肉瘤标本中，15例有BMP2mRNA的扩增，多边形的肿瘤 细胞的胞浆中可见明显的阳性染色(图1)。8例软骨肉瘤标本中6例有BMP2mRNA的扩增，多边 形及梭型的肿瘤细胞的胞浆中可检测到阳性反应(图2)。

图1　骨肉瘤胞浆BMP2mRNA表达阳性原位杂交（×400）

图2　软骨肉瘤胞浆BMP2mRNA表达阳性原位杂交（×400）

图3　骨肉瘤胞核PCNA表达阳性免疫组化（×400）

　　三、BMP2 mRNA扩增与肿瘤淋巴结转移间的关系
　　21例有BMP2 mRNA扩增的肿瘤中有5例出现淋巴结的转移，而无BMP2基因扩增的肿瘤中无1例 出现淋巴结的转移。
　　四、BMP2 mRNA扩增与肿瘤PCNA反应间的关系
　　PCNA的阳性反应为胞核的棕黄色着色(图3)。32例骨肉瘤病例PCNA和表达情况及其与BMP2 mR NA扩增间的关系如表1示。经χ2检验(χ2=3.51，p＜0.05)，可以认为有B MP2 mRNA扩增者有较高的PCNA反应。
|

表1　BMP2mRNA扩增与PCNA反应间的关系

BMP2mRNA	例数	PCNA表达(-～++)	PCNA表达(+++)
+	21	10	11
-	11	9	2

讨　　论

　　BMP家族为一组形态和功能相近的多肽，除BMP-1外均属于TGF-β超家族。目前已 有16种不同的BMPcDNA被克隆，对BMPs家族成员的研究日益深入和扩展［2，3］。BMP s的生理作用主要表现在3个方面：①胚胎发育［4］。研究发现BMPs参与了机体的发 育过程，在维持骨和软骨的形态和结构方面起了非常重要的作用。②在创伤愈合过程中可检 测到BMP基因的扩增明显增高［5］。③BMP家族的某些成员与机体肿瘤的发生和发展 密切相关。对BMP家族的研究正越来越受到人们的重视。
　　疾病中与BMP关系最为密切的为骨肿瘤，在骨肉瘤、软骨肉瘤、骨纤维异常增殖症等骨疾患 中均可检测到BMP的丰富表达［6］。进一步的研究还发现，BMP的存在与肿瘤的不良 预后(五年生存率低、化疗效果较差、易发生远处转移等)密切相关［7］。
　　作者曾检测颌骨骨肉瘤和软骨肉瘤中的BMP的表达，结果也表明肿瘤中有丰富的BMP的表达(7 5%)。目前尚无针对某一类型的特异性单抗，作者进一步检测BMP2 mRNA的扩增情况。结果表 明32例标本中有21例有BMP2 mRNA的扩增，表明BMP2在颌骨肉瘤中的发生发展中起一定作用 。
　　目前尚无较好指标检测颌骨肉瘤和软骨肉瘤的预后，颌骨肉瘤也较少发生淋巴结的转移，但 是引人注意的是，5例发生淋巴结转移的病例均属BMP2 mRNA扩增阳性组。提示BMP的存在与 颌骨肉瘤的不良预后间有一定关系。这与国外一些研究结果相似。为什么有BMP表达的肿瘤 会预后不良是令人困惑的问题，因为BMP在胚胎发育过程中促进未分化的细胞成熟并发挥成 骨作用。为了探讨此问题，作者检测肿瘤细胞的增殖活性。PCNA(proliferating cell nuclear antigen，简称PCNA)是一种细胞增殖状态的标记物，可以准确反应细胞的增殖状况 。作者利用PCNA的单抗检测肿瘤细胞的增殖活性并分析其和BMP2mRNA扩增间的关系。结果表 明，有BMP2 mRNA扩增的肿瘤有较高的PCNA表达。这提示BMP有可能通过某种机制促进肿瘤细 胞的增殖活性，从而引起肿瘤的预后不良。

作者单位：岳文（第四军医大学口腔医学 院病理科　710032）
杨连甲（第四军医大学口腔医学 院病理科　710032）　
金岩（第四军医大学口腔医学 院病理科　710032）　
董绍忠（第四军医大学口腔医学 院病理科　710032）

参　考　文　献

1，岳文，龙彦，凌涤生，等.口腔粘膜上皮癌前及癌变中PCNA和P53的表 达.实用口腔医学杂志，1998，14：19.
2，Kessler B,Tadahara K,Biniaminov L,et al.Bone morphogenetic protein-1:the type I procoliagen C-proteinase.Science,1996,271(5247):360.
3，Hino J,Takao M,Takeshita N,et al.cDNA cloning and genomic structure of hu man bone morphogenetic proteic-3B(BMP-3b).Biochem-Biophys-Res-Commun,1996 Jun 14 ,223(2):3041.
4，Kim HJ,Rice DP,Kettunen PJ,et al.FGF-BMP-and Shh-mediated signalling path ways in the regulation of cranial suture morphogenesis and calvarial bone develo pment.Development,1998 Apr,125(7):1247.
5，Si X,Jin Y,Yang L,et al.Expression of BMP-2 and TGF-beta 1 mRNA during he aling of the rabbit mandible.Eur-J-Oral-Sci,1997 Aug,105(4):325.
6，Yoshikawa H,Rettin WJ,Takaoka K.Expression of bone morpho-genetic protein s in human osteosarcoma.Immunohistochemical detection with monoclonal antibody.C ancer,1994 Jan 1;73(1):85.
7，Yoshidawa H,Takaoka K,Masuhara K,et al.Prognostic signostic significance of b one morphogenetic activity in osteosarcoma tissue.Cancer,1998 Feb 1;61(3):569.