[摘要] 目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothel ialgrowth factor，VEGF)和口腔鳞癌侵袭转移的关系。方法 采用蛋白酶谱分析法测量不同浓度VEGF作用于口腔鳞癌TSCCa细胞系及颈淋巴转移癌GNM细胞系后基质金属蛋白酶—2(matrix metal—loproteinase-2，MMP-2)和MMP-9的活性，同时用Boyden Chamber观察VEGF诱导口腔鳞癌TSCCa细胞转移的作用。结果 不同浓度的VEGF(1、5、10 ng／ml)作用于GNM细胞2h后，MMP-2和MMP-9的活性与对照组相比，差异无显著性(P>0．05)；而不同浓度的VEGF作用于TSCCa细胞2h后，MMP-2和MMP-9的活性与对照组相比，差异有显著性(P<0．05或0．01)，MMP-2和MMP-9的活性与VECF有剂量依赖关系，用VEGF l、5、10 ng／ml培养口腔鳞癌TSCCa细胞系2h，Boyden Chamber小室下室浸润的口腔鳞癌细胞数分别为(6．67±1．78)x10 4／ml、(17．17±2．38)x10 4／ml、(22．33±2．54)x10 4／ml，分别高于对照组(2．48±1．02)x10 4／ml(P<0．05或0．01)。结论 VEGF可促进口腔鳞癌细胞侵袭转移。
[关键词] 口腔鳞癌；肿瘤转移；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶类
研究发现，血管内皮生长因子(vascular endothe—lial growth factor，VECF)是重要的血管形成因子，可诱导肿瘤血管形成，在肿瘤组织中有较高表达，与肿瘤浸润和转移过程密切相关「1,2」。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达和活性在口腔鳞癌侵袭转移中起重要作用「3」；MMPs的表达及活性可受多种因素的影响，VEGF可能是其中的因素之一。我们拟通过检测外源性VECF对体外培养的人口腔鳞癌及其转移癌细胞系中MMP-2、MMP—9活性的影响，探讨VEGF与口腔鳞癌侵袭转移的关系，为研究口腔鳞癌侵袭转移的分子机制奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂和仪器 重组VECF购自美国Sig-ma公司，用无血清RPML- 1640培养液配置成10 ng／ul，置于—20℃保存待用；RPMI-1640、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；Boy-den Chamber由江苏海门麒麟医用仪器厂提供；Beckman公司液体闪烁仪，MPIAS-500多媒体图像分析仪；Beckman超低温冷冻干燥机，HV-3000多用电泳仪，垂直板凝胶电泳槽。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养 人口腔鳞状细胞癌细胞系TSC-Ca和颈淋巴转移癌细胞系GNM由湖北医科大学口腔医学院金辉喜博士建立「4」，武汉大学典藏中心保存；在含10％小牛血清的100 U／ml青、链霉素的RPMl l640培养液内，5％C02、37℃培养箱内常规传代培养。
1．2．2 标本收集及处理 待细胞生长至对数期时，更换为无血清培养基(不含酚红)继续培养12h后，加入不同浓度的VEGF，2h后按文献「5」
的方法收集培养液，冷冻抽干后标本置人—20℃冰箱保存备用，每组至少3个平行样本。临用前用双蒸水溶解，取5 ul溶解液和5 ul上样缓冲液混合后采用蛋白酶谱分析，于10％十二烷基磺酸钠—聚丙烯烍胺北胶(SDS-PAGE)电泳，清洗后于孵育液中孵育24 h，0．1％考马斯亮蓝R-250染色，按参考文献「6」的方法分析测量。
1．2．3 VEGF诱导口腔鳞癌细胞系侵袭实验 用具有上下室的Boyden chamber分析人口腔鳞癌细胞系TSCCa转移能力的改变「6」。设BSA 10 mg／ml对照组、VEGFl、5、10ng／ml 3个不同浓度组，每组Boyden chamber下室盛满混有VEGF的10％小牛血清RPMI—1640培养液200 ul。将硝酸纤维素膜放置于下室表面，套紧上室，使硝酸纤维素膜将上下室分开。在上室中加入1 ml的TSCCa细胞。置于37℃、5％CO2温育箱中培养120 min，培养结束后，计算下室浸润的人口腔鳞癌细胞数(4大格细胞数／4X10 4)，细胞数越多，说明口腔鳞癌细胞转移能力越强。
1．3统计学方法
采用t检验。
2 结 果
2．1 不同浓度VEGF作用于TSCCa细胞后MMP-2和MMP-9活性测定结果
结果见表1。
表1 不同浓度VEGF作用于TSCCa细胞后MMP-2和MMP-9活性(x±s)
各组与对照组比较，* P<0．05， **P<0．01
从表1可见，随着外源性VEGF浓度的增加，TSCCa 细胞中MMP－2和MMP－9活性随之增高，与对照组相比，差异有显著性（P＜0.05或0.01）。MMP－2和MMP－9活性增加与外源性VEGF浓度变化有剂量依赖关系。
2.2 不同浓度VEGF作用于GNM细胞后MMP－2和MMP－9活性测定结果
结果见表2。
表2 不同浓度VEGF作用于GNM细胞后MMP－2和MMP－9活性(x±s)
各组与对照组比较，*P>0．05
从表2可见，随着外源性VEGF浓度的增加，GNM细胞中MMP-2和MMP-9的活性与对照组相比增加不明显(P>0．05)，仅有轻微增加。
2．3 不同浓度VEGF诱导TSCCa细胞侵袭能力
1、5、10 ng/ml VEGF组培养120 min后，Boydenchamber小室下室浸润的口腔鳞癌细胞数分别为(6．67±1．78)X10 4／ml、(17．17±2．38)X10 4／ml、(22．33±2．54)X10 4／ml，均高于对照组(2．48±1．02)X10 4／ml(P<0．05或0．01)。
3 讨 论
基质金属蛋白酶(MMPs)是一组Zn 2+依赖性蛋白酶，由于MMP-2和MMP-9的作用底物几乎覆盖了所有的基膜成分，因此在整个MMPs中的作用最大。研究表明，MMP-2和MMP-9的表达及活性与口腔鳞癌的侵袭和转移密切相关「7」；许多因素可以影响MMPs的基因转录和活性表达，其中最主要的是生长因子和细胞因子，如IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)及VEGF等「8」。VEGF是目前所知道的最强的直接作用于血管内皮的生长因子，在体外培养中，VEGF刺激可使大小血管内皮细胞增生，诱导血管形成。不仅与胚胎发育、创伤修复、骨形成改建等生理过程有关，而且与肿瘤新生血管的形成、肿瘤生长、转移密切相关。研究发现，VEGF可能通过控制细胞穿透基膜和细胞外基质的能力，诱导新生血管生成来参与多种恶性肿瘤的浸润和转移「9」。
本研究发现，随着外源性VEGF浓度的增加，TSCCa和GNM细胞中MMP-2和MMP-9活性均有增加，但TSCCa细胞中增加更明显，提示VEGF可能通
过调控MMP-2和MMP-9活性的方式参与口腔鳞癌的转移。有学者发现多种细胞因子和生长因子如VECP等能影响MMPs的表达和活性，VEGF通过提高MMP—2和MMP-9的活性和表达，调节MMP-2和MMP-9的转录水平，诱导组织因子、蛋白水解酶及基质胶原酶的表达，改变细胞外基质和基膜，诱导肿瘤血管生成「10」。我们的研究结果显示，VECF对TSC—Ca细胞的MMP-2和MMP-9活性调节作用比GNM细胞强，这可能与两种细胞系的分化程度不同有关；TSCCa细胞来源于中度分化的舌鳞状细胞癌，CNM细胞来源于分化较差的口腔鳞癌颈淋巴结转移癌「11」，结果提示前者较后者的转移潜能更大。同时本实验还发现，VEGF可以使口腔鳞癌TSCCa细胞穿透硝酸纤维素膜基质的能力增强，VECP诱导向下室转移的细胞显著高于对照组，表明VECF能够诱导口腔鳞癌细胞的侵袭能力增强。这个结果与VECF作用于口腔鳞癌细胞上调MMP-2和MMP—9的活性相一致。 |
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