【摘要】　目的　研究C-myc癌基因与Rb抗癌基因在口 腔癌的发生及癌前病变恶变过程中的意义。方法　采用流式免疫荧光 技术对40例口腔鳞状细胞癌，10例口腔白斑和14例口腔扁平苔藓中C-myc和Rb基因蛋白的表 达量进行定量研究。结果　C-myc癌基因在口腔癌、白斑、扁平苔藓 中表达的阳性率分别为65%、30%和21%。在C-myc癌基因的平均表达量中，口腔癌明显高于白 斑和扁平苔藓，差异均有显著性(P＜0.05和P＜0.005)。Rb抗癌基因在口 腔癌、白斑、扁平苔藓中表达的阳性率分别为30%、0和7%。其中口腔癌，白斑，扁平苔藓中 的平均表达量均低于正常口腔粘膜，但差异无显著性(P＞0.05)。口腔癌不同组织 学类型之间Rb蛋白的阳性检出率无明显差异(P＞0.05)。结论　①C-myc癌基因在口腔癌前病变发展为口腔癌过程中具有重要意义。②Rb基因的表达与口 腔癌组织学分级之间无明显关系。③Rb基因表达失活可能成为口腔癌前病变癌变的一种潜在 危险。
　　【关键词】　C-myc基因　　Rb基因　　口腔　　癌　　癌前病 变

　　C-myc癌基因是一种细胞癌基因，在口腔鳞状细胞癌的发生中受到 普遍关注。Rb抗癌基因是人类发现的第一个肿瘤抑制基因，在口腔癌中常出现突变、缺失和 表达异常［1，2］。本研究采用流式细胞免疫荧光方法，观察口腔癌前病变转变为口 腔癌过程中的C-myc癌基因与Rb抗癌基因的变化，以揭示口腔癌前病变恶变的机理。

材料和方法

　　1.标本：从存档资料中挑选出口腔鳞状细胞癌40例(其中高分化19例，中分化5 例，低分化16例)，口腔白斑10例，口腔扁平苔藓14例，正常口腔粘膜3例。
　　2.抗体：鼠抗人C-myc(Ab-1)单克隆抗体为美国On cogene Science Inc，产品。兔抗人 (C-15)多克隆抗体由美国Santa Cruz Biotechnology Inc.公司出品。羊抗鼠或羊抗兔FITC- IgG 二抗由美国Dako公司出品。
　　3.流式免疫荧光染色［3］：①每例蜡块切取40μm厚的组织切片，经二甲苯脱蜡后， 梯度酒精下行入水，用网搓方法制备成单细胞样品。②抗体标记采用间接免疫荧光染色方法 。将1×109/L细胞悬液用PBS离心洗涤2次后，弃上清液，各取0.1ml分别加入1：100 稀释的鼠抗人C-myc或兔抗人Rb抗体100μl，37℃恒温水浴中孵育30min，PBS洗2次后，各加 入1：200稀释的羊抗鼠或羊抗兔FITC-IgG，37℃水浴温育30min，PBS洗涤后离心弃上清液。 各加入1.0mlPBS液，经400目滤网过滤成单细胞，上机分析。③免疫荧光染色后，将单 细胞样品涂片在荧光显微镜下观察，C-myc和Rb阳性细胞均发出绿色荧光，C-myc阳性部位主 要在胞浆，而Rb阳性部位位于细胞核。④免疫荧光检测同时设阳性对照和阴性对照。
　　4.流式细胞检测方法：采用细胞仪FACS-420型流式细胞仪(美国BD公司产品)，激发光源为2W 氩离子激光器，激发波长为488nm，输出功率为300mW。采用FITC荧光染料，用同一个激发波 长的光处理样品。FITC发出的绿色荧光，以520nm的带通滤片用于荧光检测。测量数据及图 形同时输入HP-300 Consort 30计算机，用Single histogram statistics软件进行资料处理 。
　　5.测量资料的分析方法：C-myc基因与Rb基因表达的定量分析方法，采用荧光指数(fluoresc ence index,FI)表示C-myc和Rb基因蛋白表达相对含量。并以FI＞1.0为表达阳性， FI≤1.0为表达阴性。
　　6.统计学分析：所有资料的统计学处理采用t检验和χ2检验。

结　　果

　　一、C-myc癌基因的表达(表1，图1-3)
　　40例口腔鳞状细胞癌中阳性26例(65%)，阴性14例(35%)，其平均表达量(FI值)高于正常口腔 粘膜、口腔白斑和口腔扁平苔藓，并与口腔白斑和扁平苔藓之间差异有显著性(P＜0. 05)和(P＜0.005)。10例口腔白斑中阳性3例(30%)，阴性7例(70%)，其平均表达 量与正常口腔粘膜之间差异无显著性(P＞0.05)，但与口腔鳞状细胞癌之间差异有 显著性(P＜0.005)。14例口腔扁平苔藓中阳性3例(21%)，阴性11例(79%)，其平均 表达量与正常口腔粘膜之间差异无显著性(P＞0.05)，与口腔鳞状细胞癌之间差异 有显著性(P＜0.05)

表1　各组中C-myc癌基因表达的荧光指数

分组	例数	FI范围	FI(x±s)
正常口腔粘膜	3	0.84～1.13	1.00±0.15
鳞状细胞癌	40	0.86～2.34	1.23±0.34*
扁平苔藓	14	0.84～1.09	0.94±0.08**
白斑	10	0.86～1.19	0.98±0.12***

　　注：与正常口腔粘膜比较　*　，**　，　***均P＞0.05
　　　　与鳞状细胞癌比较　**　P＜0.05，***　P＜0.005

图1　口腔鳞状细胞癌C-myc癌基因表达阳性，FI=2.34

图2　口腔白斑C-myc癌基因表达阳性FI=1.13

图3　口腔扁平苔癣C-myc癌基因表达阳性，FI=1.09

　　二、Rb基因的表达(表2，图4)
　　40例口腔鳞状细胞癌中阳性12例(30%)，阴性28例(70%)，其平均表达量低于正常口腔粘膜， 但差异无显著性(P＞0.05)。在高、中、低分化的肿瘤中，其阳性检出率之间差异 也无显著性(P＞0.05)。10例口腔白斑中阳性例数为0，即100%表达阴性。14例 扁平苔藓中阳性1例，占7%，阴性13例，占93%。其平均表达量与正常粘膜之间差异无显著性 (P＞0.05)

表2　各组中Rb基因表达的荧光指数

分组	例数	FI范围	FI(x±s)
正常口腔粘膜	3	0.79～1.12	1.00±0.18
鳞状细胞癌	40	0.56～1.43	0.92±0.16
扁平苔藓	14	0.79～1.09	0.87±0.10
白斑	10	0.77～0.98	0.84±0.09

　　注：表中各组与正常口腔粘膜比较，差异均无显著性，P＞0.05

图4　口腔鳞状细胞癌Rb基因表达阳性，FI=1.09

讨　　论

　　口腔癌的发生通常经历了上皮不典型增生或上皮萎缩的阶段。在口腔癌前病变或 癌前状态转变为口腔癌的过程中，上皮细胞也发生着质和量的改变。口腔白斑是目前公认的 癌前病变，而扁平苔藓则被归于癌前状态。本研究对C-myc癌基因的定量分析表明，口腔癌 中C-myc癌基因的表达量明显高于口腔白斑和扁平苔藓，差异有显著性。Sakai等［4］ 曾对口腔癌的C-myc产物进行定位研究，发现这些产物大量沉积在细胞分裂的染色质上， 表明C-myc基因与癌细胞的增生有关。本研究中65%的口腔癌中C-myc基因呈高表达。而在10 例口腔白斑和14例扁平苔藓中，阳性表达率为30%和21%，其平均表达量明显低于口腔癌，差 异有显著性。因此可以推测，C-myc产物在细胞核中的堆积，不仅对癌细胞的增生关系密切 ，而且对刺激上皮细胞癌变也具有重要意义。在口腔癌前病变或癌前状态为口腔癌的进程中 ，C-myc产物的表达呈逐渐增高趋势。因此，C-myc癌基因的表达量可作为观察癌前病变癌变 发展的客观指标之一。
　　Rb基因是视网膜母细胞瘤的易感基因。近年来发现，Rb基因在人体正常组织中也有不同程度 的表达，而这种表达的差异与细胞生长和细胞类型有关系。在人类许多肿瘤如白血病、骨肉 瘤、食管癌、肺癌中Rb基因均出现异常。在口腔鳞状细胞癌和疣状癌中，已发现Rb基因有缺 失和表达失活［2，6］。本研究表明，在口腔鳞状细胞癌中，Rb基因的阳性检出率 仅为30%，另外70%口腔癌Rb基因表达阴性，其平均表达量(FI值)低于正常口腔粘膜，但差异 无明显的显著性。Cance等［7］曾报道，在转移性强、恶性度高的肉瘤中，Rb蛋白表 达减少。在对本实验的40例口腔癌的组织学分级的研究中发现，高、中、低分化的肿瘤中Rb 基因的阳性检出率之间差异无显著性(P＞0.05)，提示Rb基因的表达与口腔癌的组 织学分级之间无明显关系。Sugerman等［2］曾表明，Rb基因的功能缺失将导致口腔 鳞状上皮细胞增生，对癌的发生有明显的刺激作用。本研究发现，在10例口腔白斑和14例扁 平苔藓中，Rb蛋白的阳性检出率极低，(仅1例扁平苔藓表达阳性，其余病变均表达阴性)。 因此推测，在口腔癌前病变或癌前状态中，Rb基因表达失活可能是癌变的一种潜在危险，在 病变的恶性转变中起着重要作用。