粘液表皮样癌是常见的涎腺恶性肿瘤,低分化的涎腺粘液表皮样癌侵袭和转移力强,常发生淋巴系统或远隔脏器转移,目前尚缺乏有效的化疗药物,其原因主要是它对传统化疗药物不敏感［1］。足叶乙甙(VP16)是一种抗肿瘤植物药,据报道［2］,VP16在体外对肿瘤细胞有明显的细胞毒作用,有显著的抗瘤活性,动物实验表明VP16对小鼠Lewis肺癌的肺转移有抑制作用,使转移灶减少。8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)为中药补骨脂的有效成份之一。近年来,第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室有关研究证明,8-MOP对人粘液表皮样癌高转移细胞株(Mc3)有抑制作用。本文观察VP16对Mc3的抑制作用,检测VP16对口腔肿瘤的抗癌活性,同时选择不同剂量的VP16与8-MOP联合应用,旨在观察两种药物联合应用时对Mc3细胞的抑制作用,为临床化疗合理选择理想的抗肿瘤药物,进一步治疗粘液表皮样癌及肿瘤转移等提供实验依据。

1　材料和方法

1.1　材料
　　人粘液表皮样癌细胞系MEC-1由第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室建立,其高转移细胞株克隆的筛选及其生物学特性见参考文献［3］。细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,5% CO2,37℃,饱和湿度。VP 16(大连制药厂生产),8-MOP(天津药物研究所生产),采用灭菌溶液配制成高浓度贮存液,使用前用培养液稀释至所需浓度。
1.2　细胞生长曲线测定
　　细胞计数法:细胞常规消化,配制成单细胞悬液,按照1.0×104/ml浓度接种于24孔培养板,5%CO2,37℃培养8 d,每天取1组(3个平行孔)细胞,消化后计数。实验重复3次,取均数绘制细胞生长曲线,同时计算对数生长期的细胞倍增时间。
1.3　细胞数与光吸收值的关系
　　配制不同密度的细胞悬液,其细胞数为1.0×103～3.2×105/ml,分别接种于96孔培养板,每一浓度设3个平行孔,常规培养24 h,采用MTT法测定每孔光吸收值(OD)。
1.4　MTT法药物敏感性测定
　　取对数生长期细胞,常规消化,接种于96孔培养板,1.0×103/孔,24 h后,细胞贴壁,加入6个不同浓度梯度的药液,每一浓度设5个平行孔,VP16剂量为10～3200 ng/ml;对照孔不加药,设12个平行孔。常规培养,药物作用5 d后,按常规MTT比色法测定OD值,实验重复3次,取平均值绘制药物浓度依赖曲线并计算药物的半抑制浓度(IC50值),并根据临床最大用药量(D)药物在血浆中浓度理论值(PPC)［4］计算药物的相对抗肿瘤活性(RAA)［5］。

1.5　联合用药
　　接种细胞于96孔板,选用VP16及8-MOP各4个浓度联合应用药物接触方案,5 d后以MTT法测定OD值,实验重复3次。取均数绘制联合用药剂量-效应曲线,计算IC50值及50%抑制时联合用药的合并指数(CI50)［6］。

　　判断标准:CI50<0.95为协同效应;CI50>1.05为拮抗效应;CI50介于0.96～1.04之间为相加效应。
1.6　克隆形成法测定VP16对Mc3的抑制作用
　　采用双层琼脂培养法,铺设含20%胎牛血清的RPMI 1640的底层培养基于24孔培养板,琼脂的浓度为0.5%;上层培养基琼脂浓度为0.3%,同时含有4个不同浓度梯度的药液及500/孔的细胞悬液,每组设4个平行孔,对照组不加药。常规培养2周,以每个集落细胞数等于或多于50个细胞为一个克隆,计数,实验重复2次,取均数计算克隆形成率,作图法计算VP16对Mc3克隆形成的半抑制浓度(IC50)。

2　结　　果

2.1　细胞数与OD值的关系
　　OD值随着细胞数增加而升高,采用Sigma Plot4.1软件分析细胞数量与MTT还原产物光吸收值的关系,结果(图1)所示,接种细胞数量在1.0×103～3.2×105/ml范围内与OD值呈显著正相关,相关系数r=0.96,表明MTT实验适用于该细胞株药物敏感性实验。

图1　细胞数与对应的OD值

2.2　细胞生长曲线
　　细胞倍增时间为26.4 h,Mc3细胞生长稳定(图2)。

图2　细胞生长曲线

2.3　药物敏感性实验MTT法测定
　　随着VP16药物浓度的增加,细胞生长明显抑制,其作用特点表现为明显的浓度依赖性。VP16对Mc3细胞作用的IC50值为1625.67 ng/ml,RAA值7.24(图3)。小剂量8-MOP可促进细胞增生,随着药物浓度的增加,细胞生长明显抑制,其对Mc3细胞的IC50值为75500 ng/ml(图4)。

图3　MTT法测定VP16剂量-效应曲线

图4　8-MOP剂量-效应曲线

2.4　VP16对Mc3细胞克隆形成的抑制作用
　　不同浓度的VP16不同程度抑制Mc3细胞的克隆形成,随着药物浓度增加,克隆形成逐渐减少,呈明显的药物浓度依赖性。根据克隆形成药物剂量-效应曲线作图(图5),求得IC50值为126 ng/ml,RAA值为93.4(表1)。

表1　不同剂量VP16对Mc3细胞克隆形成的影响

表1　不同剂量VP16对Mc3细胞克隆形成的影响

图5　克隆法测定VP16剂量-效应曲线 2.5　联合用药实验 　　VP16与8-MOP联合应用,可增强VP16对细胞的生长抑制作用(表2)。 表2　VP16与8-MOP对Mc3细胞联合用药药物浓度及合并指数

3　讨　　论

　　肿瘤细胞的浸润、转移过程复杂［7］。为有助于了解癌转移的重要环节,第四军医大学口腔医学院口腔生理学教研室于1990年建立了人粘液表皮样癌细胞系MEC-1,并采用裸鼠体内人工肺转移和体外细胞培养的方法从MEC-1细胞系中筛选出人粘液表皮样癌高转移细胞株(Mc3)。近年来又发现,Mc3细胞对阿霉素(ADM)、平阳霉素(PYM)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)等抗癌药物有较强的敏感性。本实验应用VP16作用于人粘液表皮样癌高转移细胞株,根据文献报道［8］加入药物后观察3～6个倍增时间,实验选用药物接触时间为5 d(4.5个倍增时间)。药物敏感性实验MTT法表明,VP16对Mc3细胞生长有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。联合用药实验所见,低浓度的VP16不能明显抑制Mc3细胞的生长,但其与不同剂量的8-MOP联合应用的药物接触方案,可增强其对细胞的抑制作用,使Mc3细胞对VP16的药物敏感性明显增强;单独用药时,小剂量的8-MOP可刺激Mc3细胞生长,浓度高则可明显抑制细胞生长。然而,VP16与8-MOP的联合用药,采用分别低于VP16 IC50的100、320和1000 ng/ml等药物浓度与低于8-MOP IC50的剂量联合应用,其联合用药的合并指数(CI)均小于0.95,分别为0.350,0.599和0.880,显示两种药物联合应用具有明显的协同抑制效应。联合用药可减少化疗药物的使用剂量,减少药物的毒性反应,延缓细胞的耐药性发生,有可能以低剂量的VP16佐以8-MOP获得与高剂量VP16单用的效果,从而减轻VP16的毒副作用,同时在人粘液表皮样癌的治疗,特别是防治转移方面可能有一定意义,值得进一步研究。
　　在克隆形成率测定试验中同时可见VP16作用于Mc3细胞,克隆形成明显减少,并且其克隆形成率减少亦与VP16药物剂量呈浓度依赖性,VP16对Mc3细胞的生长抑制和克隆形成抑制表明其在人粘液表皮样癌的治疗,特别是防治转移方面可能有一定意义。另外,值得注意的是MTT法与克隆形成法结果相比较,前者IC50值是后者的12.8倍,RAA值则后者是前者的12.9倍,而克隆形成率与肿瘤细胞的恶性程度,特别是癌侵袭和转移力有关。有资料报道［3］,Mc3细胞克隆形成与肿瘤转移率有明显的相关性,由此根据实验结果试推断,VP16可能对人粘液表皮样癌高转移细胞有一定作用。

本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 39370740)

作者单位:710032　第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室

4　参考文献

1　Bloch A. Induced cell differentiation in cancer therapy. Cancer Treat Rep, 1984,68(1):199～201
2　韩　锐.肿瘤化学预防及药物治疗.北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1991:227～278
3　吴军正,司徒镇强,刘志斌,等.涎腺粘液表皮样癌高转移细胞克隆的筛选及其生物学特性.第四军医大学学报,1998,19(1):1～4
4　张友会.现代肿瘤学.北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1993:263～264
5　Wu Junzheng, Situ Zhenqiang, Wang Wei, et al. Chemosensitivity of salivary gland and oral cancer cell lines. Clin Med J, 1992,105(12):1026～1028
6　Tsai CM, Hsiao SH. Frey CM, et al. Combination cytotoxic effects of cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ) and 5-fluorouracil with and without leucovorin against human non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Res, 1993,53(5):1079～1084
7　周柔丽.纤维粘连蛋白及层粘连蛋白与肿瘤细胞的浸润和转移.细胞生物学杂志,1985,2(7):49～54
8　Alley MC, Scudiero DA, Monks A, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res, 1988,48(3):589～601