医用材料的生物学评价已引起了人们的广泛重视，根据安全、有效的原则，理想的生物材料不仅要有临床所需的理化特性及有效性，同时还需要有良好的生物相容性。近年来,几丁质及其衍生物作为生物材料获得了广泛的重视〔1〕。本文重点研究了几丁质作为植骨材料的生物相容性。

1　材料与方法
1.1　材料
　　精制蚕蛹几丁质(中科院上海昆虫研究所)，MTT(Sigma)， ALP检测试剂盒(台湾BGH公司)，DMEM培养液（Gibco）。
1.2　方法
1.2.1　几丁质浸出液对培养人成骨细胞(OB)增殖的影响
　　①几丁质浸出液的制备
　　盘状几丁质，计算其表面积后按每平方厘米加入10 ml DMEM培养液，置于37 ℃ DMEM培养液中， 24 h后取上清，加入FBS使之成为含体积分数为10％FBS的浸出液并作为起始浓度，按倍比稀释作梯度测试。
　　②人胚成骨细胞(OB)的培养
　　按司徒镇强等〔2〕介绍的方法进行。
　　③几丁质浸出液对人OB增殖的影响
　　取第五代人OB，胰酶消化后调整细胞浓度至2×104/ml，加入96孔板，每孔100 μl。培养24 h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，加入倍比稀释的浸出液，共设6组，1/1(原始浸出液)、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，每组4孔,对照组仅加培养液。培养96 h后,进行MTT测定，结果进行统计学分析。
　　④几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
　　分组及浸出液加入同1.2.1.3, 细胞接种浓度为5×104/ml,每孔加入100 μl。培养96 h后，进行ALP测定，结果进行统计学分析。
　　⑤几丁质体内降解速度的实验研究
　　重20 mg块状几丁质，无菌条件下植入小鼠背部皮下和股部肌肉中。分别于术后2、4、6、8、10、12 周各处死4只小鼠，取出材料,干燥后称重。
　　⑥多孔几丁质组织相容性的实验研究
　　制备多孔几丁质,植入小鼠股部肌袋中，分别于术后2、4、6、8 周取材，进行材料周围软组织的肉眼观察及组织学检查。
　　⑦人OB在几丁质膜上生长及矿化的观察
　　在几丁质膜上接种人成骨细胞后，用矿化液进行培养,倒置显微镜观察。连续培养40 d，分别于3、20和40 d时取出标本,扫描电镜观察。

2　结　果
2.1　人OB的培养
　　人OB形状主要为三角形和四方形，5 d左右长满瓶底，此时细胞外观为铺路石状(图1)。用钙-钴法进行ALP染色，大部分细胞为阳性，胞浆染成棕黑色。

图1　第二代人成骨细胞(倒置显微镜，×100)

2.2　几丁质浸出液对人OB增殖的影响
　　MTT加入后4 h,各培养孔底部都有紫黑色结晶形成,基本均匀一致。测量吸光度值，经统计学分析，各组间均无显著差异(表1)。

表1　不同浓度的几丁质浸出液对人OB增殖及ALP活性的影响
 

	浸出液浓度
	对照组	1/1	1/2	1/4	1/8	1/16	1/ 32
增殖	0.63±0.02	0.61±0.06	0.59±0.04	0.64±0.05	0.66±0.08	0.58±0.06	0.62±0.03
ALP活性	0.43±0.03	0.39±0.05	0.41±0.03	0.40±0.05	0.41±0.07	0.43±0.02	0.45±0.06

2.3　几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
　　测量吸光度值，经统计学分析各组间均无显著差异(表1)。
2.4　几丁质的降解速度
　　植入皮下2周时，几丁质与周围组织广泛粘连,体积膨胀；植入4周后，体积明显缩为原来大小的1/2左右；植入6 周后完全吸收。植入肌肉间隙中约10周完全吸收(图2)。

图2　几丁质的体内降解速率2.5　多孔几丁质植入肌肉中的组织学观察

　　植入2周时组织内可见少量中性粒细胞浸润，随时间延长逐渐消失。植入4周后，材料被组织分隔成岛状，周围有较多圆形巨噬细胞，内有大量颗粒状物质(图3)，植入8周后基本上吸收。各期标本在几丁质周围无中性粒细胞、淋巴细胞聚集现象，未见材料周围有组织坏死。

图3　多孔几丁质植入肌间隙4周，材料被分割成岛状(HE，×40)

2.6　人OB在几丁质膜上的生长
　　经倒置显微镜观察，细胞3～4 h开始贴壁，约12 h左右完全伸展，约10 d长满整个膜表面。扫描电镜观察，接种3 d,细胞在几丁质膜表面形态良好,有较多伸展的突起(图4);20 d时,细胞已长满膜的表面，并开始叠层生长,局部可见合成的胶原纤维,40 d时观察到矿化结节(图5)。

图4　接种3 d，人OB在几丁质膜表面形态良好(扫描电镜，×300)

图5　接种40 d，人OB在几丁质膜表面形成矿化结节(扫描电镜，×2K)

3　讨　论
　　几丁质是一种高度疏水的物质，不溶于水和大部分一般溶剂，其分子结构中的疏水基团是N-乙酰氨基，不同的取代或不同程度的脱乙酰基处理，可以获得不同理化性能的几丁质的衍生物,有学者用几丁质和聚乳酸、尼龙、聚乙烯形成共聚物, 因此几丁质及其衍生物作为生物材料有很大的潜力〔3〕。
　　体外培养OB已成为新型植骨材料筛选和研制的一个重要内容〔4〕。 通过观察OB在材料上的贴壁、伸展情况,测定细胞在材料上DNA、蛋白质合成及ALP活性, 可以初步判定材料表面环境对骨组织的相容性。
　　侯春林等〔5〕的实验证实，几丁质具有良好的生物相容性，其浸出液不影响成纤维细胞的生长，无热源反应，无溶血反应，无致敏性。但是有人报道几丁质有低致敏性〔6〕。我们采用6种浓度的几丁质浸出液进行测试，从而较全面地评价其细胞毒性。实验结果证实几丁质浸出液不影响人OB的增殖和ALP活性。从形态观察结果来看，OB可以在几丁质膜表面贴附，且伸展良好。根据六类毒性分级法，几丁质的毒性为0～1级〔7〕。OB可以在几丁质膜上生长40 d时形成矿化结节,表明材料对细胞具有较好的相容性。但细胞在几丁质表面生长较慢,说明本实验中所用的几丁质表面并不是OB生长的理想环境，这可能与分子中的疏水基团和分子表面电荷有关。
　　几丁质体内的降解过程为：几丁质在脱氨基酶的作用下变为纤维素，在纤维素酶的作用下成为纤维二糖，并最终在纤维二糖酶的作用下生成葡萄糖〔1〕,因而对机体完全无害。其降解速度与分子中所含的乙酰基数目有关,乙酰基数目越多,降解速度越慢,另外加醛后其分子间产生交联,降解速度也变慢。根据我们的实验观察，几丁质植入不同的部位吸收速度不同，植入皮下组织中仅6周就完全降解,这可能是由于不同部位的吞噬细胞数量不同所致。
　　综合体内与体外实验结果,可以认为几丁质对骨组织也具有良好的相容性,适于作为植骨材料而进行进一步研究,但在材料的表面处理上仍有改进的必要。

作者单位：第四军医大学口腔医学院(陈富林　毛天球　吴军正)
　　　　　中国科学院上海昆虫研究所　(曹梅讯)

参考文献

1John P. Chitin,chitosan and related enzymes. Academic press,1984.135～148
2 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养, 西安. 世界图书出版公司, 1996.111～112
3 Kurita K:Efficient graft copolymerizations onto chitin derivatives.In Cardoso R edited:The international research on chitin and chitosan.6th international conference on chitin and chitosan,Poland:ZWAT ltd,1994.67～71
4 Ishaug SL,Paucher D,Siman RT,et al.Osteoblast function on synthetic biodegradable polymers.J Biomed Mater Res,1994,28:1445
5 侯春林,卢建熙,曹梅讯,等.几丁质生物学特性的研究. 中国修复与重建外科杂志,1993,2:215
6 Hirano S,Noishiki Y. The blood compatibity of chitosan and N-acylchitosans. J Biomed Mater Res, 1985.19:413
7 上海市第二医科大学生物材料研究室编.非直接接触血液的医用生物材料生物学性能的测试.上海：上海卫生出版社,1985.26～39