[摘要]  目的  对将使用于义齿磁性固位体的两种特殊不锈钢(S1与S2)的生物安全性进行初步检测，评价其临床应用的生物相容性。方法  用纯钛及钴铬合金作比较，通过将材料浸提液与体外培养的L—929细胞接触培养，进行细胞的形态学观察及二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)比色，评价材料对细胞造成的毒性损害程度。结果  细胞的形态学观察显示，随着培养天数的增加，阳性对照组中的脱落细胞、死亡细胞逐渐增多。其余各组细胞大部分继续贴壁生长。细胞密度增加。MIT比色法结果显示，非磁性不锈钢(S1)和磁性不锈钢(S2)浸提液对细胞有轻微的毒性，细胞相对增殖率(RGR)降低3％，钴铬合金对细胞表现出1级细胞毒性，RGR降低11％，但4种金属材料组与阴性对照组的吸光度值之间的差异均克统计学意义(P>0．05)。结论  S1、S2两种不锈钢仅具有极微弱的细胞毒性，符合临床应用的要求。
【关键词】  义齿；磁性附着体；细胞毒性
    磁性固位体由于其特殊的固体原理而越来越多地被应用于全口义齿、覆盖义齿、种植义齿及颌面赝复体等修复中，本实验通过体外培养细胞的形态学观察及二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)比色法「1」，对在义齿磁性固体中将使用的两种特殊不锈钢的生物相容性进行初步检测，并与口腔科常用的钴铬合金、纯钛的生物相容性进行比较，评价两种特殊不锈钢的生物安全性。
1　　材料与方法
1．1  实验试样分组及来源
    A组：非磁性不锈钢(S1)；B组：磁性不锈钢(S2，中国科学院沈阳金属研究所)；C组：纯钛(日本松风公司)；D组：钴—铬合金(贺利氏古莎齿科有限公司)；E组：PVC材料阳性对照组(沈阳化工集团永新有限公司)；F组：RPMl　l640液阴性对照组。实验用细胞株选用对数生长期的L—929细胞。
1．2实验材料及设备
    RPMl　l640培养基(Serva，Germany，含10％胎牛血清，青霉素100 U／ml，链霉素100ug／ml，pH=7．2)，MTT(Biotec，Sino—AmeriCan)，使用前新鲜配制，过滤除菌，浓度为5 g／L.二甲基亚砜(DMSO)。C02培养箱(D—63450，Heraeus，Germany)，倒置相差显微镜(CK—40，Olympus，Japan)，自动酶标测试仪(ELx-800，biO-Tek instruments，Inc，American)，24孔和96孔培养板(NuNcTM，Denmark)。
1．3  实验方法
    试样浸提液与细胞悬液的制备：将A—E组材料制成长、宽、厚度分别为10、9、3 mm的长方体，灭菌后置于24孔培养板中，按浸提液与试样表面积之比为0．55ml／cm2的比例加入RPMl l640培养液，置于37℃、95％相对湿度、5％C02培养箱中72h，得到材料浸提液。选取快速生长期的L—929细胞，用RPMl l640液调制成细胞密度约为1．0X105个／ml的细胞悬液，备用。
     浸提液与细胞接种培养及结果观察：取96孔培养板，每板均选出6组孔，加入细胞悬液100 ul，培养24 h。在1—5组孔中分别加入A-E组的材料浸提液100 ul，在第6组孔中加入RPMl 1640培养液100 ul后继续培养。分别于培养后的1、2、3、4、5 d各取一块培养板，在倒置相差显微镜下观察活细胞的形态并摄影。在培养孔中加入5 g／L的MTF液，每孔 20 ul，继续培养4 h后，吸出孔内培养液，用PBS液振荡洗涤3次，每孔中再加入DMSO 150 ul，微振荡20 min后，用自动酶标仪检测吸光度值(A)，实验波长选为490 nm。
    实验数据分析：计算细胞相对增殖率(RGR)，并参照六级毒性评级标准作毒性级评定「2」，RGR(％)：(实验组的A／阴性对照组的A)X100％。用SPSS软件，将各实验组的吸光度值作方差分析和均数间两两比较的统计学分析。

图1  培养1 d后PVC材料组L—929细胞生长情况(倒置显微镜  x 200)

图3  培养5d后PVC材料组L—929细胞生长情况(倒置显微镜  x200)

2  结果
    培养1 d，阳性对照组中，贴壁生长的细胞呈梭形或多角形，部分细胞脱落，悬浮的细胞呈圆形或不规则形，胞膜增厚，胞质内出现空泡及颗粒状物质，胞核致密。其余各组的细胞几乎全部贴壁生长，细胞轮廓清晰，呈长梭形或多角形，核质比例正常，胞质均匀。
    培养3d，阳性对照组中，脱落的细胞增多，细胞收缩变小，胞膜变厚，核质增多，胞核固缩。其余组内，贴壁的细胞密度增大，形态正常，可见少许悬浮的衰老细胞，其胞质内可见空泡或颗粒物。
    培养5d，阳性对照组中贴壁的细胞大部分脱落，细胞变圆、变小，胞质、胞核浓缩，可见许多质膜崩解、核膜破裂的死亡细胞。其余组内细胞大部分继续贴壁生长、密集排列，也可见少量悬浮的退化细胞及个别的死亡细胞。
    不同材料浸提液对细胞生长的影响见图1—4，各实验组的吸光度值以及材料毒性级评定结果见表1、2。

图2  培养1 d后不锈钢材料组L—929细胞生长情况(倒置显微镜  x200)

图4  培养5d后不锈钢材料组L—929细胞生长情况(倒置显微镜  x2m) 

    表1  务实验组A490mm值    (x±s)

与F组比较，*p<0．05，**p<0．01
    表2  务实验组的细胞相对增殖率及材料的毒性级评定

    各实验组A490mm值的统计学分析结果显示，各时间点4种金属材料组与阳性对照组A490mm值的差异均有统计学意义(p<0．05或p<0．01)。而4种金属材料组与阴性对照组的A490mm值之间的差异均无统计学意义(p>0．05)。
3  讨论
    目前，国外已研制出多种用不锈钢包裹的精密制作的义齿磁性固位体产品，可以减少口腔内的漏磁，并提高其耐腐蚀性「3」。我们结合国内外的研究成果，开发新的义齿磁性固位体，通过使用轭铁材料、内装永磁体、优化结构和磁路设计，发挥其功能和安全可靠性。其中使用的轭铁材料采用了超纯高铬铁素体不锈钢，它以Cr为主要元素，是一种软磁合金(S2)，具有高的磁导率和低的矫顽力。我们还选用了高级的非磁性不锈钢(S1)用作包裹磁体的外壳材料，它以Cr和Ni为主要元素，具有优良的力学性能和耐腐蚀性。
    体外细胞毒性试验是筛选医用材料生物安全性的一种方法，它与材料在体内的毒性作用有相关性。细胞形态学观察法可以直观地看到外来因素作用后细胞形态与结构的改变以及细胞增殖与死亡情况，可以对材料的细胞毒性作出初步判断「4」。本实验采用了MTT比色法，可以灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度「5」。
    实验采用纯钛及钴铬合金作为对照，检验两种特殊不锈钢对L—929细胞的体外细胞毒性。结果显示，S1与S2浸提液均轻度抑制细胞生长，除培养第1天外，均显示出轻微的细胞毒性作用(RGR降低3％)，这可能与合金析出的铬离子、镍离子、钼离子等对细胞内的生化过程产生影响而抑制细胞的增殖有关「6」。在培养的全过程中，钴铬合金的析出液抑制L—929细胞的生长，表现出1级细胞毒性(RGR降低11％)，这与其组成成分中含有较大比例的Co、Cr、Mo元素有关，它们对细胞内某些基因表达、蛋白质合成等机制产生一定的破坏作用，从而抑制了细胞的增殖「7」。而纯钛目前已被应用于骨组织内，实验中纯钛析出液没有表现出毒性作用，呈现了良好的细胞相容性。从实验结果还可以看出，随着培养天数的增加，A490nm。值逐渐升高。但在4 d以后，细胞增殖趋势变缓，这可能与培养液成分及细胞密度发生变化而抑制细胞增殖有关。