各种类型灭菌器对牙科手机灭菌效果检测
摘要：目的 检测各种灭菌器对牙科手机灭菌的效果。 方法 用五种压力蒸汽灭菌器对五种微生物人为污染的牙科手机进行灭菌，然后对灭菌效果进行无菌检测和用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测HBsAg。并且用毛细管法比较不同种类灭菌器蒸汽穿透程度。结果 两种预真空式压力蒸汽灭菌器杀菌效果最好，可达100％，其中一种HBsAg清除率可达100％，其冷空气排除最彻底。结论 预真空式压力蒸汽灭菌器效果可靠，有关下排气式灭菌器的灭菌效果是否会因牙科手机在灭菌前进行清洗而有所提高，也有待于进一步实验证明。
牙科手机在治疗过程中密切接触患者唾液、血液、龈沟液和牙菌斑，未经灭菌处理的牙科手机有可能携带单纯疱疹病毒、结核分支类杆菌、HBV甚至HIV等[ ]，因此，牙科手机是口腔科临床上造成交叉感染最具危险性的器械之一[ ]。目前，欧美一些发达国家已普遍使用压力蒸汽灭菌法对牙科手机进行灭菌处理 [ , , , ]，我国正在逐渐推广该方法。压力蒸汽灭菌器按照工作原理分为两类，一类是下排气式，另一类是预真空式。下排气式的灭菌原理是利用重力置换原理，使热蒸汽在灭菌器中从上而下，将冷空气由下排气孔排出，全部由饱和蒸汽取代，利用蒸汽释放的潜能使物品达到灭菌。预真空式是利用机械抽真空的方法，使灭菌器内冷空气排除彻底，蒸汽得以充分穿透到物品各个部位进行灭菌。达到灭菌时间后抽真空使物品迅速干燥。一般来说，预真空类灭菌器冷空气排除彻底、灭菌无死角、效果也更可靠[ ， ]。
目前，临床使用的灭菌器种类较多，灭菌效果也不一致，临床对灭菌器灭菌效果的报道只局限在个别灭菌器，并且不是针对牙科手机灭菌效果进行检测。牙科手机由于制造结构上的特殊性，要达到灭菌标准有一定难度，所以本实验选择人为污染的牙科手机作为灭菌对象，检测不同类型的灭菌器的灭菌效果。
1. 方法
1.1设备和器材
五种灭菌器：
①下排气式1号灭菌器：灭菌温度132℃±0.5℃；灭菌时间3.5分钟；灭菌全过程所需时间29分钟±1分钟。
②下排气式2号灭菌器：灭菌温度135℃±0.5℃；灭菌时间4分钟；灭菌全过程所需时间12分钟±1分钟。
③下排气式3号灭菌器：灭菌温度135℃±1℃；灭菌时间3.5分钟；灭菌全过程所需时间7分钟±1分钟。
④预真空式4号灭菌器：灭菌温度134℃；灭菌时间3.5分钟；灭菌全过程所需时间44分钟±1分钟。
⑤预真空式5号灭菌器：灭菌温度134℃±0.5℃；灭菌时间4分钟；灭菌全过程所需时间35分钟±1分钟。
1.2实验方法
本实验共分为六组，一至五组为压力蒸汽灭菌法对不同种类微生物人为污染牙科手机的杀灭实验；第六组采用毛细管法对不同种类灭菌器蒸汽穿透程度进行比较。
一至五组分别为：第一组是大肠杆菌（8099）染菌实验组；第二组是金黄色葡萄球菌（ATCC6538）染菌实验组；第三组是白色念珠菌（ATCC10231）染菌实验组；第四组是变形链球菌“C”染菌实验组；第五组是HBsAg污染实验组。
1.2.1菌悬液配制
⑴用0.03mol/L的PBS将大肠杆菌8099，金黄色葡萄球菌ATCC6538，白色念珠菌10231的第三代培养物配成107~108cfu/mL的菌悬液。用麦氏比浊管测定菌悬液浓度。
⑵变形链球菌菌悬液配制：
①将未知浓度的变形链球菌悬液倍比稀释为10-1 cfu/mL，10-2 cfu/mL，10-3 cfu/mL，10-4 cfu/mL， 10-5 cfu/mL， 10-6 cfu/mL 的悬液，反复轻吹吸摇匀后，用450波长测OD值。
②分别取各浓度悬液0.1mL接种于变形链球菌培养基平板，每种浓度的悬液接种两个平板，37℃，微氧培养48小时。
③以菌落在30~300cfu之间的平板为计数对象，取平均值，再乘以10为相应稀释液的浓度，然后根据稀释倍数推算原液浓度。最终，以原液浓度达到107~108cfu/mL为配液标准，并记录相应的 OD值。
④以此OD值作为判断107~108cfu/mL变形链球菌悬液浓度的标准。
⑶HBsAg悬液配制：用洗脱液（0.03mol/L PBS加10%小牛血清）将1mg/mLHBsAg稀释至100mg/mL。
1.2.2实验步骤：
1.2.2.1分别用菌悬液浸泡污染牙科手机机头5cm。每种菌悬液浸泡污染152支牙科手机。沥干。37℃恒温干燥30分钟，制成室验用污染手机。
1.2.2.2将152支污染牙科手机随机分为实验组与阳性对照组。实验组共150支污染牙科手机；按五种灭菌器、每种30支污染牙科手机进行五组实验，每种灭菌器中有15支不包装裸露消毒、15支塑封包装后消毒。阳性对照组为2支不经灭菌处理的污染牙科手机。阴性对照组为同批次培养基直接培养。
1.2.2.3用3M生物指示管对五种灭菌器灭菌性能分别进行生物监测。
1.2.2.4灭菌效果检测：
1.2.2.4.1无菌操作取出灭菌处理后的实验组牙科手机和阳性对照组牙科手机，每支手机分别置于24mL/管的培养基中培养，连续观察记录培养结果。大肠杆菌（8099）和金黄色葡萄球菌（ATCC6538）污染的牙科手机置于硫乙醇酸盐液体培养基中，37℃恒温、需氧、连续培养5天。白色念珠菌（ATCC10231）污染的牙科手机置于霉菌液体培养基中，22℃恒温、需氧、连续培养7天。变形链球菌“C”污染的牙科手机置于液体M**中,37℃恒温、微氧、连续培养5天。同批实验用培养基直接培养为阴性对照。
1.2.2.4.2无菌操作取出灭菌处理后的实验组和阳性对照组污染HBsAg的牙科手机，每支手机分别置于24mL/管的洗脱液中，于旋涡混合器上震荡40秒，取出牙科手机，采用ELISA试剂盒检测方法对洗脱液进行HBsAg抗原性检测，同批实验用洗脱液作为阴性对照。
1.2.2.5将化学指示卡置于Helix管（长145cm，管口直径1.5mm，盲端密封可置化学指示卡）盲端内，分别将放有化学指示卡的Helix管与牙科手机同时放入五种灭菌器内进行蒸汽穿透程度检测。化学指示卡颜色由浅黄色完全变为棕黑色，结果判断为合格。
2. 结果
2.1实验一：对大肠杆菌杀灭实验
2号、4号和5号灭菌器灭菌处理后大肠杆菌检测均为阴性；1号灭菌器包装消毒组出现1例阳性，余为阴性，杀菌率为96.7%，3号灭菌器包装消毒组出现2例阳性，余为阴性，杀菌率为93.3%。这组实验说明2号、4号和5号灭菌器灭菌效果较好。 （见表-1）
表-1五种类型灭菌器对大肠杆菌污染的牙科手机灭菌效果检测
灭菌器类型 裸露消结果：阳性/总例数 包装消结果：阳性/总例数 合格率
1号灭菌器 0/15 1/15 96.7%
2号灭菌器 0/15 0/15 100%
3号灭菌器 0/15 2/15 93.3%
4号灭菌器 0/15 0/15 100%
5号灭菌器 0/15 0/15 100%
阳性对照组菌落数：3.55x108 cfu/mL
阴性对照组：培养基直接培养均无菌生长
2.2实验二：对金黄色葡萄球菌杀灭实验
2号、4号和5号灭菌器灭菌处理后金黄色葡萄球菌检测均为阴性；1号灭菌器包装消毒组出现1例阳性，裸露消毒组出现2例阳性，杀菌率为90%，3号灭菌器包装消毒组出现1例阳性，裸露消毒组出现1例阳性，杀菌率为93.3%。这组实验说明2号、4号和5号灭菌器灭菌效果较好。 （见表-2）
表-2五种类型灭菌器对金黄色葡萄球菌污染牙科手机灭菌效果检测
灭菌器类型 裸露消结果：阳性/总例数 包装消结果：阳性/总例数 合格率
1号灭菌器 2/15 1/15 90%
2号灭菌器 0/15 0/15 100%
3号灭菌器 1/15 1/15 93.3%
4号灭菌器 0/15 0/15 100%
5号灭菌器 0/15 0/15 100%
阳性对照组菌落数：2.35x108 cfu/mL
阴性对照组：培养基直接培养均无菌生长
2.3实验三：对白色念珠菌杀灭实验
4号和5号灭菌器灭菌处理后白色念珠菌检测均为阴性，1号灭菌器包装消毒组出现1例阳性，裸露消毒组出现1例阳性，杀菌率为93.3%，2号灭菌器裸露消毒组出现1例阳性，余为阴性，杀菌率为96.7%。3号灭菌器包装消毒组出现1例阳性，余为阴性，杀菌率为96.7%。这组实验说明4号和5号灭菌器灭菌效果较好。 （见表-3）
表-3 五种类型灭菌器对白色念珠菌污染的牙科手机灭菌效果检测
灭菌器类型 裸露消结果：阳性/总例数 包装消结果：阳性/总例数 合格率
1号灭菌器 1/15 1/15 93.3%
2号灭菌器 1/15 0/15 96.7%
3号灭菌器 0/15 1/15 96.7%
4号灭菌器 0/15 0/15 100%
5号灭菌器 0/15 0/15 100%
阳性对照组菌落数：2.8x107 cfu/mL
阴性对照组：培养基直接培养均无菌生长
2.4实验四：对变形链球菌杀灭实验
4号和5号灭菌器灭菌处理后变形链球菌检测均为阴性；1号和2号灭菌器裸露消毒组和包装消毒组各出现1例阳性，杀菌率均为93.3%。3号灭菌器裸露消毒组出现1例阳性，余为阴性，杀菌率为96.7%。这组实验说明4号和5号灭菌器灭菌效果较好。 （见表-4）
表-4 五种类型灭菌器对变形链球菌污染牙科手机灭菌效果检测
灭菌器类型 裸露消结果：阳性/总例数 包装消结果：阳性/总例数 合格率
1号灭菌器 1/15 1/15 93.3%
2号灭菌器 1/15 1/15 93.3%
3号灭菌器 1/15 0/15 96.7%
4号灭菌器 0/15 0/15 100%
5号灭菌器 0/15 0/15 100%
阳性对照组菌落数：4.28x107 cfu/mL
阴性对照组：培养基直接培养均无菌生长
2.5实验五：对HBsAg抗原性破坏实验
2号和4号灭菌器灭菌处理后HBsAg抗原性检测均为阴性；1、3、5号灭菌器均有一例HBsAg抗原性检测阳性，S/N值分别为2.18、2.2和2.24。这组实验说明2号和4号灭菌器对HBsAg的破坏效果较好。 （见表3-5）
表-5 五种类型灭菌器对 HBsAg污染的牙科手机灭菌效果检测
灭菌器类型 裸露消结果：阳性/总例数 包装消结果：阳性/总例数 合格率
1号灭菌器 0/15 1/15 96.7%
2号灭菌器 0/15 0/15 100%
3号灭菌器 1/15 0/15 96.7%
4号灭菌器 0/15 0/15 100%
5号灭菌器 1/15 0/15 96.7%
阴性对照组：2号洗脱液S/N值为1.08
2.6实验六: Helix管蒸汽穿透程度比较
4号灭菌器放置的Helix管内化学指示卡经灭菌处理后的颜色由浅黄完全转变为棕黑色，达到合格标准。其他4个灭菌器放置的Helix管内化学指示卡经灭菌处理后有一定的颜色变化，且存在一定深浅差异，但均未完全转变为棕黑色，未达到标准合格色。根据Helix管检测结果4号灭菌器蒸汽穿透性能最强。而3号灭菌器化学指示卡颜色变化最浅、对狭细腔隙蒸汽穿透性相对较弱。
表-6 化学指示卡对五种灭菌器检测结果比较
灭菌器类型 Helix 145cm Helix 20cm
1号灭菌器 深棕黄 棕色
2号灭菌器 深棕黄 棕色
3号灭菌器 棕黄 深棕黄
4号灭菌器 棕黑色 棕黑色
5号灭菌器 深棕黄 棕色
以上实验显示4号和5号灭菌器灭菌效果较好，4号灭菌器蒸汽穿透性能最强。
3. 讨论
压力蒸汽法是国际公认的可靠的灭菌方法，压力蒸汽灭菌器自从其问世以来随着应用领域的多样化在不断地更新。通常通过灭菌效果、干燥效果、可操作性和所需时间对压力蒸汽灭菌器进行综合评价。由于牙科手机是具有狭细腔隙的器械，所以灭菌处理存在一定难度，这需要灭菌器具有良好的热穿透力。另外，牙科手机属于结构精密的器械，在选择灭菌器时也要考虑对机械性能的影响情况。但无论如何，灭菌器的灭菌效果是选择灭菌器的核心问题。
本实验是通过实验室污染牙科手机来检测各种压力蒸汽灭菌器的灭菌效果。所选用的菌悬液是大肠杆菌（8099），金黄色葡萄球菌（ATCC6538）,白色念珠菌（ATCC10231）,变形链球菌“C”和100mg/mLHBsAg悬液。之所以选择这几类污染物，是因为大肠杆菌（8099），金黄色葡萄球菌（ATCC6538）分别是消毒实验用肠道菌和化脓菌抗性代表菌；白色念珠菌（ATCC10231）是消毒实验用真菌抗性代表菌；变形链球菌是口腔内常见菌属。HBsAg是作为消毒实验用病毒抗性代表，悬液浓度为100mg/mL是依据《消毒技术规范》而定的，其明确规定乙型肝炎表面抗原破坏实验的悬液浓度为检测方法灵敏度的50000倍,本实验所采用的试剂盒灵敏度为2ng[ ]。
本实验通过菌悬液直接浸泡牙科手机进行实验室人为污染，通过培养基直接浸泡灭菌后牙科手机进行灭菌后效果检测。上述人为污染方法可污染到牙科手机内部细小腔隙，牙科手机经灭菌器灭菌后，经上述培养法检测，可检测牙科手机内部的灭菌效果，这样即便牙科手机表面污染菌被杀灭、内部污染菌未被杀灭，细菌培养结果仍是阳性。与利用无菌试管盛装菌悬液进行灭菌器灭菌效果检测的方法相比，本实验的检测方法更能说明灭菌器对牙科手机的灭菌效果[ ]。与棉拭子表面涂抹培养法相比本实验的培养方法可检测牙科手机内部涡轮组件和管道腔隙的灭菌情况，由于牙科手机内部是灭菌难点，因此本实验的培养方法可较准确的检测牙科手机灭菌效果[ ， ]。
通过实验一、二、三、四我们看出4号和5号灭菌器杀菌效果最好，均达到100%灭菌。4号和5号这两类灭菌器均属预真空式压力蒸汽灭菌器，其冷空气排除彻底，饱和蒸汽能够充分穿透各个部位，干燥效果好，但是灭菌全过程时间较长约35~45分钟，灭菌温度为134~135℃。其余三类灭菌器属于下排气式灭菌器，1号灭菌器灭菌全过程时间较长约30分钟，虽然带干燥程序，但干燥效果不好，灭菌温度为132~133℃。2号灭菌器灭菌全过程时间较短约12分钟，不带干燥程序。3号灭菌器灭菌全过程时间最短约7分钟，干燥时间可自选，一般需10分钟左右[ ]。2号和3号灭菌器灭菌温度为135℃。灭菌器灭菌全程的时间受灭菌原理、灭菌器的载量和灭菌器初始温度等影响。这五类灭菌器维持在灭菌温度的时间均为4分钟左右。综合实验一至实验五的结果，4号灭菌器的杀菌性能和破坏HBsAg抗原性方面均存在明显优势；5号灭菌器的杀菌性能明显优于其它三种灭菌器,但HBsAg抗原性破坏实验检测有一例阳性，ELISA试剂盒检测S/N值为2.24。4号和5号这两种灭菌器均属于预真空式灭菌器，以上结果说明预真空式灭菌器杀菌效果较其他类型灭菌器更可靠。通过实验六，我们可以看出，4号灭菌器冷空气排除最彻底，蒸汽穿透力强，能与物品接触充分，这种性能可减少物体内部可能存留的灭菌死角，确保灭菌效果。3号灭菌器的热蒸汽穿透性较其他灭菌器弱，这表明该灭菌器对狭细腔隙中残留冷空气不易排除、蒸汽不易到达细小腔隙，用于手机类结构复杂的器械，其灭菌效果可能因此而受影响。1号、2号和5号灭菌器Helix管检测蒸汽穿透力没有明显差别。由于牙科手机结构精密且复杂，涡轮腔内存在很多细小的腔隙，因此热蒸汽需具有足够强的穿透力才能达到这些部位发挥作用。预真空式压力蒸汽灭菌器在这一性能上存在相对优势。如果器械灭菌后不立即使用，需要保存，那么须经干燥处理，在这一点上，预真空式压力蒸汽灭菌器也存在明显优势,其干燥较彻底。
另外，细菌载量是压力蒸汽灭菌器灭菌效果的影响因素之一，如果牙科手机在灭菌前进行清洗，细菌载量减少后，其他三种灭菌器可能能达到较好的灭菌效果[ ]。
小 结
通过对几种灭菌器对人为污染牙科手机灭菌效果的检测，我们得出初步结论：预真空式灭菌器用于牙科手机灭菌效果更可靠。以上对各种灭菌器灭菌效果的评价来源于较小的样本量，为得到更深入的信息，还有待于扩大样本量继续实验、检测。有关下排气式灭菌器的灭菌效果是否会因牙科手机在灭菌前进行清洗而有所提高，也有待于进一步实验证明。
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