臭氧对于细菌与生物膜杀灭作用的研究

目的：牙科治疗台水管路污染可形成生物膜及回吸现象。为获得牙科治疗台水系统水质污染情况的第一手准备数据，采用有效的消毒方法，彻底阻断治疗台水污染为媒介的交互感染。
方法： 随机采集牙科治疗台各部位的水样，计数检测细菌污染的菌丛含量，对培养后污染细菌的种类进行鉴定；采用循环、适宜浓度的臭氧水作为消毒剂，检测实验室与临床消毒效果；观察适宜浓度的臭氧水与正常细胞接触24h后细胞形态变化。
结果：消毒前，牙科治疗台水系统被大量的致病和非致病微生物严重污染，细菌污染均数为每毫升水样1.58万-4.47万菌丛（cfu/ml），这些异样菌在牙科治疗台水系统内部以多种形式的生物膜生长；消毒后，牙科治疗台水系统内细菌含量为0，无生物膜形成；适宜浓度的臭氧水与正常细胞接触24h，对细胞的生长无影响。
结论 牙科治疗台水系统污染情况严重，手机连接管内的生物膜为重要污染环节；适宜浓度的臭氧水可以对牙科治疗台水系统实现适时无菌化处理。

1.材料和方法

1.1临床取样：随机选择日常应用的牙科综合治疗台6台，于每日晨开诊前采集水样，连续取样6天。
1.1.1.储水罐内水样采取：打开储水罐注水口，用无菌移液管深入水罐下部，吸取罐内存水10ml，将取出的储水罐内水样置于无菌三角瓶内，封口，送检。
1.1.2.手机连接管水样采取：用酒精灯烧灼消毒手机连接管金属出水口,启动治疗台脚踏开关,用无菌三角瓶接取水样10ml，封口，送检。
1.1.3.三用枪出水水样采取：用酒精灯烧灼消毒三用枪，开启三用枪出水，用无菌三角瓶接取水样10ml，封口，检测。
1.1.4.生物膜的采取：①储水罐内生物膜的采取：打开储水罐上口，用无菌接种环刮取黏附在罐壁上的絮状碎片；②手机连接管生物膜的采取：启动治疗台脚踏开关，用手指在手机连接管末端（连接管的近手机端）间断加压，可见与连接管内径和形状一致的套袖状生物膜从水道内脱出。

1.2污染水样的细菌学检测：无菌操作，将污染水标本接种在普通琼脂血平板和MCK平板上，37℃，24~48h，根据菌落形态，G染色、氧化酶初步鉴定，再根据生化反应（采用法国梅里埃中国有限公司提供的微量生化反应系统）进一步对细菌做鉴定。生物膜标本于显微镜下观察。
1.3.对牙科治疗台水系统行动态消毒的实施方法：将东线公司水灭菌系统与牙科治疗台水系统连结（图）。

    由于臭氧水特殊的物理特性，系统设计去除原牙科治疗台的储水罐，用一个总储水罐，以泵为动力，采用循环供水的方式；系统自动调整臭氧水消毒液生成机的臭氧浓度，是牙科治疗台管道内臭氧水的臭氧浓度保持适宜（用靛蓝二磺酸钠分光光度法GB/T 15437-1995测定）。

1.4.本消毒方法实施后牙科治疗台水系统水样的检测：
1.4.1.口腔治疗台水系统水样的临床检测：因本研究采用臭氧水直接连通各牙科治疗台水系统管道（原储水罐已取消），故消毒后的细菌学检测只对手机连接管和水枪的出水样本进行，对于此二部位样本的采集和检测方法同安装臭氧消毒之前。
1.4.2.适宜浓度臭氧水对细胞生长影响的检测：细胞（Hep-2）长成单层96孔板，同时设正常细胞对照，细胞与臭氧水混合2h、4h、8h、16h、24h，按细胞培养方法培养后，在显微镜下观察细胞形态。
使用统计学方法：采用方差分析、F检验和q检验。

2.结 果
2.1牙科治疗台水系统污染情况的检测结果：
2.1.1.治疗台水系统各部位细菌污染检测结果：储水罐平均菌丛含量2.46±0.392CFU/ml（最高值3.47CFU/ml，最低值1.58CFU/ml）；手机连接管菌丛含量3.66±0.48CFU/ml（最高值4.47CFU/ml，最低值2.78CFU/ml）；水枪菌丛含量2.61±0.55CFU/ml（最高值3.36CFU/ml，最低值1.91CFU/ml）。经方差分析各牙科治疗台间无显著性差异，反应出各治疗台均存在污染严重的情况；q检验储水罐与手机连接管之间呈显著性差异，可以认为储水罐的污染水经过手机连接管后又混入了回吸的二次污染，加重手机连接管内水的污染程度。见表1。

2.2.2.牙科治疗台水系统污染的细菌种类检测结果：以上污染所检出的细菌种类包括致病菌和非致病菌，致病菌包括：支气管败血鲍特氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假单胞菌；非致病菌包括：皮氏伯克氏菌、霉菌/酵母菌、非解糖鞘氨醇单细胞。
2.2.3.生物膜的观察结果：对牙科治疗台水系统生物膜的显微镜下观察显示，储水罐中生物膜生物相较为复杂，包含细菌、真菌、藻类和其他杂质；手机连接管中生物膜的生物相比较单一，主要由细菌、有机物碎片（破碎的血细胞样物）等组成。

3.臭氧消毒效果的检测结果
3.1.对牙科治疗台临床水样的检测结果：对以上选择的6台牙科治疗台，通入适宜浓度的臭氧水后，随机采集水样，于10min、20min、1h、4h、24h、48h、3d、7d、10d、20d对水样进行抽样检测，细菌含量均为0。
3.2.对生物膜的消除作用：对牙科治疗台水系统持续通入适宜浓度的臭氧水后，用肉眼观察并用无菌接种环刮壁，于显微镜下观察，均未发现细菌贴壁生长，不能形成生物膜。
3.3.对细胞生长影响的观察结果：实验表明适宜浓度的臭氧水与正常细胞接触后，对正常细胞的生长没有影响。

讨 论

    1963年，Black对牙科临床设备进行取样培养发现，牙钻手机可以被患者口腔微生物污染，从而首次报道了经此途径发生交叉感染的可能性[2]。而后，人们发现在日常的牙科治疗中，由口腔治疗台释出的水被大量的致病微生物和非致病微生物严重污染。污染微生物来源于治疗台的供水和高速涡轮手机在患者口腔内停转瞬间的回吸[3 4]。在进行牙科治疗时，治疗台的污染水经牙钻手机释放进入患者口腔，导致医院内感染的可能，并形成汽雾污染诊室环境[5]。

    污染的治疗台水系统的细菌一般称作异养菌（heterotrophic bectaria）[5 6],国外报道牙科治疗台水系统中异养菌的含量（HPC）一般为每毫升数万至数十万个菌丛[4]。我们对治疗台各部位污染水样的检测结果，细菌污染均数为每毫升水样1.58万-4.47万菌丛（CFU/ml），较国外报道数量低，可能是由于我们只计算悬浮细菌数量，而未将生物膜内的细菌数量计算在内的原因。

    异养菌在牙科治疗台水系统内部以多种形式的生物膜（biofilm）的方式生长[7]。国外大量的研究表明，牙科治疗台水系统中生物膜是普遍存在的。由于治疗台水系统官腔狭窄，对于流过的水、其内壁表面积相对较大，水中的悬浮细菌与管壁距离短。容易沉积，管道中水的流速低与经常停滞，均有利于生物膜的形成。另外，生物膜在多种类的塑料、橡胶管中生长迅速，所以，在牙科治疗台水系统的管道内，生物膜以很快速度生长，有时甚至堵塞水管路。本项目对从储水罐刮壁下来和从手机连接管内部取出的膜状物显微镜下观察，均为生物相的生物膜，此类生物膜贴附于水系统的表面，并不断脱落而进入水系统中，因此牙科治疗台水系统内壁的生物膜如果未经有效的清除，在其中通过的水即便是经过消毒的，亦会成为污染水。本研究结果，手机连接管内菌丛含量显著高于储水罐，可以认为储水罐的污染水经过连接管时，由于管道内生物膜的脱落，加重了污染所致。储水罐有清洗的可能，而内管路没有进行任何处理。

    患者在接受牙科治疗时接触污染的牙科水有导致感染的危险，特别是对免疫力低下者，如老年人、接受化疗的患者、吸烟者、孕妇、呼吸道疾病患者和其他系统性疾病患者尤为有明显。近几年来国外报道，假单细胞、肺炎军团菌、分支杆菌等具较强致病力的病原菌相继在牙科水道中检测到。1996年，美国加洲一名死于军团菌的口腔医生的牙科治疗台水道内检测到高浓度的同种军团菌[8]。本研究从污染水样中检测到支气管败血鲍特氏菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌等致病菌。这样的污染水通过牙钻手机进入患者口腔，对患者健康极具危害，而由于回吸现象造成的交互感染是以往无法避免的，防回吸或其它措施都不是100%地解决问题，且防回吸装置失效时操作者无法知晓。

    1996年，美国牙科协会（ADA）针对牙科治疗台水系统的污染问题，制订了一个理想标准，即要求用于非外科手术的牙科水的细菌含量在每毫升200个菌丛（200CFU/ml）以下[1]。为达到此标准，目前国内、外主要采用四种方法：1.采用独立的供水系统，投入大量资金装备制纯水设备。这种做法先期投资和运行成本都很高，在纯水制造的过程中近于60%的水被浪费掉，系统无法解决纯水输送管路中滋生的病菌和回吸现象，纯水的环境更加适合病菌的生长。2.在牙钻手机与连接管的衔接处放置过滤装置，该装置必须时常更换，且价格昂贵。3.化学处理，建屋顶水箱定期投药和检测，该系统投药量要根据用水量、时间、温度经常调节，对残留药物的污染无法祛除。4.采用防回吸措施，带防回吸装置的手机和治疗台造价较高，不可能放弃现有使用的手机和治疗台全部更换新设备，所有的防回吸措施都不是100%的解决问题，随着时间的延续防回吸效应会逐步地减弱或消失，这个过程操作者无法控制和知晓，防回吸不能解决管路内部的污染问题。在这里我们要强调一下东线公司的抗交互感染的理念：以消（毒）为主、以防为辅。“消灭敌人是保存自己最有效的手段“毛主席在抗日战争时期的教导同样也适合我们现在的院内抗交互感染工作。
臭氧（O3）是一种强氧化剂，1840年德国人Schorbein发现并命名[9]。臭氧在水中的实际反应机理十分复杂，其反应途径包括氧原子的直接反应和包括羟游离基（OH?）在内的游离基反应，同时在水介质内进行[10]。臭氧在水中比较快速分解并导致高浓度的羟离子[OH?]的形成，大部分[OH?]转化为（OH?），（OH?）同水溶液中组分的反应为主要反应。羟基游离基（OH?）与氧原子一样具氧化性，可以分解一般氧化物难以破坏的有机物，而且反应完全、速度快。臭氧具有广谱杀灭微生物的作用，臭氧水中的羟基游离基（OH?）比氧原子的作用更强、更快[11]。在臭氧的应用领域，目前中国的电解臭氧技术已处于世界领先的水平。
我们应用这个原理，加上东线公司独有专利的工程技术，将牙科治疗台的水系统进行改造，成功地解决了口腔治疗用水全自动的动态、适时、灭菌供给。特殊的设计还避免了臭氧在诊室空气中的挥发。
口腔科门诊的特点是病人共用治疗台，两个病人之间交替的间隔时间有时仅有5-10分钟。为避免病人之间的交互感染，前一个病人污染治疗台水系统的各种病原微生物必须在此间隔时间内彻底杀灭。本研究结果显示，适宜浓度的臭氧水作用1.0min，细菌杀灭率可达100%，臭氧既还原为氧气，对环境没有影响。符合防止交叉感染的要求。因此，用臭氧水作为牙科治疗台的消毒手段，可杜绝病人通过牙病治疗交互感染的可能。实现了治疗台供水系统的自动、适时的无菌化，彻底阻断了牙科治疗过程中的交互感染，该系统是授益于广大患者和医务人员，实现现代口腔医疗理念的基础设备。在此基础之上口腔医疗用水、用气将有可能实现安全的定量标准，规范和保障口腔医疗的安全。（由于系统原因，文中彩色图象部分请参看DVD光碟）

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